頂空氣相色譜法測定生脈注射液中乙醇殘留量

龔 源，吳 杰

(復旦大學附屬金山醫(yī)院藥劑科，上海 201508)

生脈注射液由紅參、麥冬和五味子的提取物配制而成，是臨床常用補益類中藥制劑，具有擴張血管、增加冠狀動脈流量、強心、升高血壓、抗休克、抗心絞痛及對化療藥進行增效減毒等作用[1-2]。在制備過程中，藥味經(jīng)水提醇沉、溶劑回收等步驟，乙醇難以避免地殘留在制劑中，并隨著臨床使用進入患者靜脈，增加不良反應發(fā)生概率，并可能對患者造成嚴重毒害[3]。生脈注射液中乙醇殘留量的檢測方法未見相關文獻報道，本研究根據(jù)國際人用藥品注冊技術協(xié)調會指導原則[4]及《中華人民共和國藥典》[5]的相關要求，采用頂空氣相色譜法測定生脈注射液中乙醇殘留量，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 7890A氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測器；Agilent 7694型頂空進樣器；Agilent Chemstation工作站；均購自安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 藥品與試劑

生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字Z31020241，批號：SM120601、SM120602、SM120603、SM120604、SM120605和SM120606)；無水乙醇(上海凌峰化學試劑有限公司，色譜純，批號：090625)；水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為HP-5柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；載氣為氮氣，流速為1 ml/min；分流比為1 ∶1；氫氣40 ml/min，空氣40 ml/min；檢測器溫度250 ℃；進樣口溫度200 ℃；恒溫50 ℃保持6 min。頂空進樣：平衡溫度80 ℃，平衡時間10 min，進樣量1 ml。對照品乙醇峰理論塔板數(shù)≥160 000，樣品乙醇峰與相鄰峰的分離度≥3.0。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備：精密量取無水乙醇，加去離子水配制成濃度為0.01%(V/V)的對照品溶液。移取該溶液1 ml，置于20 ml頂空瓶中，密封。

2.2.2 供試品溶液的制備：精密量取生脈注射液1 ml，置于20 ml頂空瓶中，密封。

2.3 色譜條件考察

2.3.1 頂空平衡時間：按“2.1”項下色譜條件，選用0.01%乙醇對照品，在不同頂空平衡時間(5、10、20和30 min)下進行測定，記錄色譜圖，考察頂空平衡時間對乙醇色譜響應的影響。結果表明，平衡時間5 min不足以令乙醇在氣液兩相中分配平衡，而10、20和30 min時乙醇響應值相近，10 min足以令乙醇在兩相中分配平衡，故頂空平衡時間選擇10 min，見表1。

表1 不同頂空平衡時間對響應值的影響Tab 1 Effects of different headspace equilibrium time on chromatographic response

2.3.2 分流比：按“2.1”項下色譜條件，選用0.01%乙醇對照品，在不同分流比條件下(1 ∶1、1 ∶2、1 ∶10和1 ∶20)進行測定，記錄色譜圖，考察分流比對乙醇響應值的影響。結果表明，分流比在1 ∶1～1 ∶20之間的乙醇響應值基本一致，但本方法適用于樣品中殘留溶劑微量的檢測，故選擇更高進樣量的1 ∶1，見表2。

表2 不同分流比對響應值的影響Tab 2 Effects of different split ratio on chromatographic response

2.3.3 柱溫：按“2.1”項下色譜條件，選用供試品溶液，在不同柱溫條件下(40、50和80 ℃)進行測定，記錄色譜圖，考察柱溫對乙醇與相鄰易干擾峰的分離比的影響。結果表明，柱溫40 ℃時，乙醇與相鄰兩峰的分離度高，但后出峰的峰形較差且運行時間偏長，而柱溫80 ℃時，乙醇峰與相鄰兩峰不能基線分離，故選擇50 ℃作為柱溫，見圖1、表3。

表3 不同柱溫對色譜分離度的影響Tab 3 Effects of different column temperature on chromatographic resolution

2.3.4 載氣流速：按“2.1”項下色譜條件，選用供試品溶液，在不同載氣流速條件下(1.0、2.0和2.5 ml/min)進行測定，記錄色譜圖，考察載氣流速對乙醇與相鄰易干擾峰的分離度的影響。結果顯示，載氣流速越大，乙醇峰形越尖銳，運行時間越短，但過高的載氣流速會降低乙醇與鄰近易干擾組分色譜峰的分離度，故選擇1.0 ml/min的載氣流速，見圖2、表4。

2.4 線性關系考察與檢測限測定

精密移取無水乙醇1 ml，置于100 ml容量瓶中，加去離子水稀釋定容配制成濃度為1%(V/V)的母液，再精密移取母液適量，置于容量瓶中，加去離子水稀釋定容，分別配制成濃度為0.020%、0.010%、0.005%、0.002%和0.001%的系列對照品溶液。精密移取上述系列對照品溶液1 ml，分別置于20 ml頂空瓶中，密封。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以對照品峰面積為縱坐標(Y)，以對照品濃度(%，V/V)為橫坐標(X)，進行線性回歸?；貧w方程為Y=77 000X+5.404 4，

A. 恒溫40 ℃；B.恒溫50 ℃；C.恒溫80 ℃A. constant temperature 40 ℃; B. constant temperature 50 ℃; C. constant temperature 80 ℃圖1 不同柱溫對色譜分離度的影響Fig 1 Effects of different column temperature on chromatographic resolution

A.流速1.0 ml/min；B.流速1.5 ml/min；C.流速2.0 ml/minA. flow rate 1.0 ml/min; B. flow rate 1.5 ml/min; C. flow rate 2.0 ml/min;圖2 不同載氣流速對乙醇分離度的影響Fig 2 Effects of different flowing rate of carrier gas on chromatographic resolution

載氣流速/ml/min101520乙醇保留時間/min313822271771與相鄰峰的分離度325/336343/347342/336

r=0.998 1。結果表明，乙醇濃度在0.001%～0.02%范圍內線性關系良好。按3倍信噪比計算，檢測限為0.000 06%(V/V)。

2.5 加樣回收率試驗

配制0.008%、0.010%、0.012%的乙醇對照品溶液，分別移取該溶液1 ml，置于20 ml頂空瓶中，密封，制備標準對照品溶液；分別精密移取0.5 ml上述標準對照品溶液，置于20 ml頂空瓶中，另加0.5 ml生脈注射液，搖勻密封，制備加標樣品溶液；再取生脈注射液1 ml置于頂空瓶中，密封，制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。按如下公式計算加樣回收率：加樣回收率(%)=(A加×2-A樣)/A標×100%；A加為加標樣品檢出的峰面積；A樣為生脈注射液供試品檢出的峰面積；A標為標準對照品檢出的峰面積。結果表明，乙醇在高、中及低3個濃度下的加樣回收率分別為96.26%、101.42%及91.37%，平均回收率為96.35%，RSD為4.26%。

2.6 精密度試驗

取對照品溶液1 ml，置于頂空瓶密封，配制6份，按“2.1”項下色譜條件進樣，計算峰面積的相對標準偏差為4.8%<5.0%，符合要求。

2.7 生脈注射液中乙醇殘留量測定結果

對6批生脈注射液樣品進行測定。結果顯示，乙醇的理論塔板數(shù)>160 000，分離度>3.00，檢出量均不超過《中華人民共和國藥典》(2015年版)的限度，表明本方法用于測定生脈注射液中的乙醇殘留量可行，見表5。

表5 生脈注射液中乙醇殘留量測定結果Tab 5 Determination of alcohol residue in shengmai injections

3 討論

3.1 測定方法的選擇

中藥注射液中有機溶劑殘留的檢測較繁瑣，原因在于中藥注射液成分復雜，含有大量不可揮發(fā)成分，水溶性差。而采用氣相色譜直接進樣容易污染進樣口和色譜柱，長期使用會對色譜儀器造成不可逆的損害。有機溶劑一般無紫外吸收，故不宜使用常用的液相色譜-紫外檢測方法進行檢測[6]。頂空進樣法在中藥的有機溶劑殘留檢測中應用較廣泛[7-13]，用于測定中藥注射液的揮發(fā)性成分已有較多文獻報道，方法較成熟。本方法采用頂空進樣法檢測生脈注射液中乙醇殘留，干擾少，分離度、理論塔板數(shù)較高。

3.2 頂空參數(shù)的選擇

本方法采用靜態(tài)頂空進樣法，為獲得真實可靠的檢測結果，對頂空體積、平衡時間進行了優(yōu)化，最終確定了樣品體積1 ml、平衡時間10 min的參數(shù)。水在生脈注射液中占大部分，故本研究采用去離子水作為空白對照[14]。本方法的總運行時間為15 min，比較適合制藥工業(yè)大批量樣品的質量控制，其檢測結果可為生脈注射液的質量標準提供數(shù)據(jù)支持。

3.3 乙醇殘留監(jiān)測的意義

中藥注射液在生產(chǎn)過程中常用有機溶劑提取法進行提取，乙醇以其價格低廉、易去除及對人體的安全性較好等優(yōu)點被廣泛應用。《中華人民共和國藥典：三部》(2015年版)關于化學殘留物的測定中，規(guī)定乙醇為第3類溶劑殘留，不得超過0.5%[5]。本研究檢測結果顯示，生脈注射液的乙醇殘留量較低，臨床安全性較好。

[1]李勤，劉宏.生脈注射液的藥理作用及臨床應用[J].醫(yī)學綜述，2005，11(10)：950-952.

[2]吳嘉瑞，楊樹誼，張曉朦，等.基于Meta分析的生脈注射液治療冠心病心絞痛系統(tǒng)評價[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21(22)：222-225.

[3]程民，蔣春海，黃萍.1012例生脈注射液不良反應/事件分析[J].安徽醫(yī)藥，2011，15(2)：250-253.

[4]International Conference on Harmonization.Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use：The ICH Process[N].[2003-02-26].http://www.ich.org/fileadmin/Public _Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q3C/Q3C_R6_Step_4.pdf.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：三部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：通則67-通則72.

[6]何小穩(wěn).藥物中揮發(fā)性成分樣品前處理方法的研究與應用[D].石家莊：河北醫(yī)科大學，2011.

[7]竇曉蓉，王振華，杜勤，等.頂空氣相色譜法測定中藥酒劑中甲醇、乙酸乙酯、正丙醇、正丁醇、仲丁醇、異丁醇和異戊醇[J].中藥新藥與臨床藥理，2017，28(2)：227-231.

[8]關曉娟.頂空進樣氣相色譜法測定薄荷藥材中薄荷腦的含量[J].中華中醫(yī)藥學刊，2011，29(5)：1160-1161.

[9]郭青，伍乃英，吳曉燕.頂空進樣氣相色譜法篩選并測定脈絡寧注射液中有機溶劑殘留量[J].中國藥學雜志，2011，46(4)：300-303.

[10] 梁選革，馮俊富，張若燕，等.頂空氣相色譜法測定清開靈注射液中乙醇的殘留量[J].醫(yī)藥導報，2013，32(12)：1627-1630.

[11] 梁選革，張若燕，劉莉麗.頂空氣相色譜法測定紅花注射液中乙醇殘留量[J].中國藥事，2012，26(1)：28-30.

[12] 張赟赟，嚴赟，羅佚.頂空毛細管氣相色譜法測定血栓通注射液中有機溶劑殘留量[J].中醫(yī)藥信息，2014，31(4)：67-69.

[13] 鄒義栩，劉月，吳春敏.頂空毛細管氣相色譜法測定苦參素注射液中乙醇和丙酮的殘留量[J].藥物分析雜志，2012，32(3)：447-450.

[14] 柴欣生，付時雨，莫淑歡，等.靜態(tài)頂空氣相色譜技術[J].化學進展，2008，20(5)：762-766.