新疆伊犁地區(qū)赤霞珠葡萄成熟過程中花色苷組成及含量變化研究

張珍珍，鄧玉杰，陳新軍，盧丕超，劉汝婧，古麗娜孜，袁浩

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）（2.新疆中信國安葡萄酒業(yè)有限公司,新疆瑪納斯 832200）

花色苷是紅葡萄果實(shí)中重要的一種類黃酮物質(zhì)，主要位于葡萄果皮細(xì)胞的液泡中，它能賦予葡萄果實(shí)和葡萄酒紅色色調(diào)，對(duì)葡萄酒的感官品質(zhì)有重要影響。花色苷還可與其它物質(zhì)（如單寧）化合，從而影響葡萄酒的口感[1,2]。歐亞種葡萄與葡萄酒中的花色苷主要是包括花青素(矢車菊色素，Cyanidin)(Orange-red)、花翠素(飛燕草色素，Delphinidin)、甲基花青素(芍藥色素，Peonidin)、3’-甲基花翠素(牽?；ㄉ?，Petunidin)、和二甲花翠素(錦葵色素，Malvidin)在內(nèi)的5種花色素的單糖苷，及其乙?；?duì)香豆?；?、咖啡?；瘑翁擒昭苌颷3,4]。

花色苷是一類具有類黃酮骨架的色素物質(zhì)，通過對(duì)其骨架結(jié)構(gòu)的修飾可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。這些修飾包括糖苷化、甲基化和?；Ｌ烊淮嬖诘幕ㄉ栈旧隙家蕴擒栈男问酱嬖?，連有一個(gè)或多個(gè)糖基[5]。糖苷化修飾是花色素的一種重要的修飾反應(yīng)，它可以在很大程度上增強(qiáng)花色苷的親水性和穩(wěn)定性，糖苷化修飾對(duì)后面的?；揎椧簿哂泻荜P(guān)鍵的作用[6]?；ㄉ盏念伾c花色苷B-環(huán)上取代基數(shù)目有很大關(guān)系，B-環(huán)上取代基數(shù)目越多，花色苷越偏向于藍(lán)色色調(diào)?；ㄉ?B-環(huán)的 3’和 5’位甲基化取代可使花色苷的最大吸收波長(zhǎng)變大[7～9]。甲基化修飾也是類黃酮類物質(zhì)常見的一種修飾反應(yīng)，大多數(shù)（90%）研究報(bào)道的已經(jīng)鑒定結(jié)構(gòu)的花色苷都是基于6種基本花色苷結(jié)構(gòu)（花葵素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷、3’-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、3’-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷和 3’5’-二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷），3種甲基化花色苷3’-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、3’-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷和 3’5’-二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷占研究報(bào)道的花色苷的20%以上。在葡萄果實(shí)中，B-環(huán)甲基化修飾的花色苷占其總花色苷的75%左右。在大多數(shù)植物中花色苷都以?；问酱嬖?，花色苷的?；揎椫饕袃煞N類型：脂肪族?；头枷阕艴；痆10～12]。在葡萄中，大約有30%的花色苷分別以其乙?；?、香豆?；涂Х弱；问酱嬖?，也有極少量以阿魏酰化形式存在[13～15]。

新疆葡萄酒普遍存在釀酒時(shí)顏色較好，但褪色快的情況，而花色苷是呈色的主要決定物質(zhì)，因此，花色苷是決定釀酒葡萄及葡萄酒顏色的主要物質(zhì)，而釀酒葡萄果實(shí)的花色苷除了受自身基因型的影響外，葡萄中花色苷類物質(zhì)的構(gòu)成及含量也會(huì)受地域、栽培條件、氣候條件和成熟度等多種因素的影響[16～21]。

本實(shí)驗(yàn)以伊犁產(chǎn)區(qū)的釀酒葡萄赤霞珠果實(shí)為原料，采用液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用檢測(cè)分析葡萄成熟發(fā)育過程葡萄中不同類型花色苷成熟過程中的變化規(guī)律，研究結(jié)果的完成可以為今后更深入地認(rèn)識(shí)環(huán)境因素如何影響葡萄果實(shí)中花色苷不同類型的修飾提供一些依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以伊犁產(chǎn)區(qū)種植的的赤霞珠釀酒葡萄為原料，樣品采集根據(jù)Boulton等[22]所述方法進(jìn)行。將新鮮的葡萄果實(shí)放入冰袋中，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室于-40 ℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)前，將果皮剝離并用液氮研磨，冷凍干燥，干燥后的粉末于-40 ℃冰箱中保存待用。

甲醇、乙腈、甲酸和乙酸均為色譜純，購于Fisher(Fairlawn，NJ，USA)公司；乙酸乙酯為分析純，購于北京化學(xué)試劑公司；超純水采用 Milli-Q(Milipore，Bedford，MA)系統(tǒng)制備的超純水。標(biāo)樣二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品購于Extrasynthese SA (Genay，F(xiàn)rance)公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

KG 2200B型超聲波清洗器；HZS-H型水浴振蕩器；GL-20G-II型離心機(jī)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；HPLC-MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源(ESI)及Agilent Mass Hunter B.04.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國Fisher (Fairlawn，NJ，USA)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Kromasi l100-5C18柱(4 mm×250 mm，65 μm)；流動(dòng)相A為水:甲酸:乙腈=92:2:6(V/V)；流動(dòng)相B為水:甲酸:乙腈=44:2:54(V/V)，洗脫程序：0～18 min，10%～25% B：18～20 min，25%B；20～30 min，25%～40%B：30～35 min，40%～70% B：35～40 min，70%～100%B：流速：1 mL/min；柱溫：50 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：525 nm；進(jìn)樣量 30 μL[23]。

1.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜采用電噴霧離子源(ESI)；正離子模式；離子掃描范圍：100～1500 m/z；霧化器壓力：241.33 kPa；干燥氣流速：10 L/min；干燥氣溫度：350 ℃；選擇了多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式識(shí)別和量化[24,25]。每個(gè)葡萄酒樣品一式兩份檢測(cè)。

1.4 花色苷的提取

葡萄果皮中花色苷的提取：稱取5.00 g葡萄皮干粉，浸入25 mL含90%甲醇溶液中，先超聲萃取10 min，再在25 ℃下避光搖床萃取30 min，然后8000 r/min、14 ℃離心10 min，取上清液，重復(fù)提取5次。最后合并上清液，30 ℃真空旋蒸蒸發(fā)除去甲醇，用甲醇定容至5 mL。樣品用0.45 μm水系濾膜過濾后上樣。

1.5 花色苷的定性

本研究的花色苷定性工作基于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄酒研究中心建立的“葡萄與葡萄酒花色苷HPLC-UV-MS/MS指紋譜庫”的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，通過對(duì)樣品HPLC-UV-MS/MS圖譜中質(zhì)譜信息、光譜信息和保留時(shí)間與譜庫及文獻(xiàn)報(bào)道比對(duì)分析從而確定各樣品中各花色苷的種類與結(jié)構(gòu)[26]。

1.6 花色苷的定量

建立5～500 mg/L之間、9個(gè)水平、三個(gè)重復(fù)的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)應(yīng)在0.999以上，做二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的外標(biāo)定量，其它花色苷以相當(dāng)于二甲花翠素-3-葡萄糖苷（Malvidin-3-O-glucoside）的含量計(jì)。

1.7 數(shù)據(jù)處與分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Office Excel 2003，繪圖采用OriginPro 9.064位。

2 結(jié)果與討論

2.1 2016年伊犁地區(qū)赤霞珠葡萄成熟過程中花色苷含量的變化

圖1 赤霞珠葡萄果實(shí)成熟過程中花色苷的含量Fig.1 Content of anthocyanins in the ripening of Cabernet Sauvignon grape

2016年從伊犁赤霞珠葡萄果皮中分別共檢測(cè)到了15種花色苷，其中二甲基花翠素葡萄糖苷是成熟發(fā)育過程中主要的花色苷，始終占總花色苷的30%以上。

如圖1所示，從花色苷成熟過程中的總量來看，伊犁地區(qū)赤霞珠葡萄果實(shí)成熟發(fā)育過程中花色苷總量在轉(zhuǎn)色30 d前就快速增加達(dá)到最高值300.21 mg/L，之后又急速下降，但是在轉(zhuǎn)色41 d以后又出現(xiàn)了一次增加，在轉(zhuǎn)色51 d的時(shí)候之后持續(xù)下降，至采收期時(shí)降至266.07 mg/L。

2.2 2016年伊犁地區(qū)赤霞珠葡萄果實(shí)花色苷組成比例

如圖2所示，從花色苷總量和不同類型的花色苷含量來看，不同類型在伊犁表現(xiàn)不同。由以上結(jié)果可以看出，伊犁地區(qū)葡萄果實(shí)中總花色苷和各種類型的花色苷都有明顯差異，并且葡萄果實(shí)中總花色苷和各種類型的花色苷含量受葡萄生長(zhǎng)地區(qū)的響也不相同。

圖2 赤霞珠葡萄果實(shí)中不同類型花色苷的含量Fig.2 Content of different types of anthocyanins in Cabernet Sauvignon grape

2.3 2016年伊犁地區(qū)赤霞珠葡萄果實(shí)花色苷組成的變化

圖3是2016年份伊犁赤霞珠葡萄果實(shí)從轉(zhuǎn)色第10 d到采收的過程中乙酰化、香豆?；臀歹；ㄉ照伎偦ㄉ盏陌俜直茸兓瘓D。如圖所示，3’-取代花色苷占總花色苷的比例從20.57%到26.88%變化。成熟發(fā)育早期所占比例較高，在轉(zhuǎn)色第30 d時(shí)，花色苷總量快速上升至300.21 mg/L，此時(shí)3’-取代花色苷的比例降至22.96%。在花色苷總量達(dá)到峰值后減少的過程中，3’-取代花色苷占總花色苷的比例也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，至轉(zhuǎn)色第51 d降至最低，僅有20.57%。這個(gè)過程中也表現(xiàn)出了在花色苷總量達(dá)到峰值后減少的過程中，3’-取代花色苷的減少比 3’5’-取代花色苷的減少更快。

伊犁赤霞珠葡萄果皮中甲基化花色苷占總花色苷的比例呈現(xiàn)緩慢的上升趨勢(shì)，變化范圍從76.62%～84.40%，其最高值出現(xiàn)在采收期。從轉(zhuǎn)色30 d到采收期之間，花色苷總量減少了34.14 mg/L，其中甲基化花色苷減少了23.86 mg/L，降低了9.60%，未甲基化花色苷減少了10.28 mg/L，降低了19.6%，未甲基化花色苷降低的比例高于甲基化花色苷，由以上結(jié)果我們可以推測(cè)未甲基化花色苷的穩(wěn)定性不如甲基化花色苷。

伊犁?；ㄉ照伎偦ㄉ盏谋壤?0.90%～33.64%之間呈緩慢下降趨勢(shì)，香豆?；ㄉ照伎偦ㄉ盏谋壤▌?dòng)較大，在花色苷積累達(dá)到最大值以前（轉(zhuǎn)色30 d）有明顯的上升趨勢(shì)，此后隨著總花色苷的下降香豆?；ㄉ盏暮坑休^小的破動(dòng)。而乙?；ㄉ照伎偦ㄉ盏谋壤龥]有顯著性變化。說明赤霞珠葡萄果實(shí)成熟發(fā)育后期花色苷的減少主要由未?；ㄉ蘸鸵阴；ㄉ盏臏p少引起，香豆?；容^穩(wěn)定，其含量不隨總花色苷的急劇減少而減少。

圖3 伊犁地區(qū)赤霞珠葡萄果實(shí)花色苷組成的含量Fig.3 Content of anthocyanin of Cabernet Sauvignon grape in Yili area

3 結(jié)論

3.1 3’-取代花色苷和 3’5’-取代花色苷：從伊犁地區(qū)的花色苷含量來看，3’5’-取代花色苷占總花色苷的比例為 70%～90%不等，3’-取代花色苷所占總體花色苷的比例為10%～30%不等，伊犁地區(qū)的葡萄中的3’-取代花色苷和 3’5’-取代花色苷占總花色苷的比例明顯高于伊犁相應(yīng)樣品中的比例。3’5’-取代花色苷是赤霞珠葡萄果實(shí)成熟發(fā)育過程中的主要花色苷類型，占花色苷總量的70%以上。在赤霞珠葡萄果皮中花色苷積累至最大值后，隨花色苷總量的減少3’-取代花色苷占總花色苷的比例降低。

3.2 甲基化取代：在我們檢測(cè)的伊犁產(chǎn)區(qū)的樣品中，甲基化的花色苷所占比例為80%～85%，而未甲基化修飾的花色苷僅占10%～24%。葡萄果實(shí)成熟發(fā)育過程中的花色苷主要以甲基化形式存在，并且甲基化花色苷占總花色苷比例變化不大。在赤霞珠蛇葡萄中，當(dāng)葡萄果皮中花色苷積累至最大值后，隨花色苷總量的減少甲氧基化花色苷占總花色苷的比例增大。這可能是由于甲基化的花色苷比未被甲基化的花色苷穩(wěn)定。

3.3 ?；涸谝晾绠a(chǎn)區(qū)的檢測(cè)中，花色苷發(fā)生酰化的比例相對(duì)較低占總花色苷的40%～50%，并且主要是乙?；幕ㄉ眨阴；ㄉ蘸拖愣辊；ㄉ照伎偦ㄉ盏谋壤谄咸压麑?shí)成熟發(fā)育過程中的變化不同。乙?；ㄉ照伎偦ㄉ盏谋壤诔嘞贾槠咸压麑?shí)成熟發(fā)育過程中緩慢下降，香豆?；ㄉ照伎偦ㄉ盏谋壤谄咸压麑?shí)成熟發(fā)育過程中呈現(xiàn)無規(guī)律的變化。

3.4 總的來說，伊犁的花色苷在成熟過程中不同類型有不同的變化，但花色苷的生成到后期的積累情況并不是很理想，褪色較快程度較大，對(duì)于后期的釀酒中顏色的變化可能會(huì)有直接影響，有待于進(jìn)一步的實(shí)踐來證明，研究結(jié)果的完成可以為今后更深入地認(rèn)識(shí)環(huán)境因素如何影響釀酒葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過程中不同類型花色苷生成與積累提供一些依據(jù)。

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