PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路調(diào)控人參皂苷素Rb1對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌的作用

臧安緣，冷雪，李其芳

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)省部共建中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110847)

急性心肌缺血一直是威脅人類健康的常見心血管類疾病，如何有效的控制缺血是治療的關(guān)鍵點(diǎn)。NO(nitric oxide, NO)是一種生物體內(nèi)能使血管平滑肌舒張的內(nèi)源性小分子物質(zhì)，同時(shí)兼具保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞生存和保護(hù)心肌的作用，作為生成NO的一氧化氮合成酶(endothelial NOS,eNOS)則起到了關(guān)鍵的作用[1-4]。很多研究證實(shí),相關(guān)藥物在治療心肌缺血性損傷發(fā)生機(jī)制中NO及eNOS都有著一定的變化，同時(shí)NO的變化也與細(xì)胞凋亡機(jī)制有關(guān)[4-6]。同時(shí)現(xiàn)已證實(shí),PI3K/Akt在血管形成上的重要作用，他可以磷酸化后激活eNOS生成NO，AKT被認(rèn)為是血管形成中的關(guān)鍵因子[7]。課題組前期研究表明人參皂苷素Rb1具有保護(hù)心肌缺血的作用[8]，在此基礎(chǔ)上利用異丙腎上腺素(ISO)復(fù)制急性心肌缺血模型，觀察PI3K-AKT-eNOS信號(hào)通路在人參皂苷素Rb1減輕大鼠心肌缺血中的調(diào)控作用，進(jìn)一步探討心肌缺血的發(fā)生機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g，由遼寧省本溪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2013-0009。

1.2 主要試劑

人參皂苷素Rb1(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)130-526)；ISO(Sigma公司，批號(hào)101443898)；NO ELISA試劑盒(基爾頓生物科技(上海)有限公司，批號(hào)DRE20010)；Real Time RT-PCR試劑盒(TaKaRa，批號(hào)DRR047A)，全部引物由 TaKaRa 公司合成，見表1。

PI3K、AKT、P-AKT(北京博奧森生物技術(shù)公司)；TBS緩沖液、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG等(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)(09D24C31、10B11B38、112586、112971)；FLPI2-MOOR激光散斑實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)(英國moor公司)。

表1 引物序列

1.3 方法

1.3.1 急性心肌缺血大鼠模型的構(gòu)建

取SD大鼠48只，雌雄不限，隨機(jī)分為4組，每組12只，分別為空白對(duì)照組、模型組、人參皂苷素Rb1低劑量(10 mg/kg)組、人參皂苷素Rb1高劑量組(20 mg/kg)組。各組均腹腔注射給藥(1 mL/100 g體質(zhì)量)，空白對(duì)照組、模型組分別給予等量的生理鹽水。連續(xù)給藥5 d，每天1次。開始給藥后的第4天和第5天，除空白對(duì)照組外，其余各組連續(xù)2次皮下多點(diǎn)注射給予ISO (30 mg/kg)，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水，給藥體積均為1 mL/100 g體質(zhì)量。

1.3.2 HE病理染色觀察大鼠心肌形態(tài)變化

取大鼠各組心臟組織，4%多聚甲醛固定72 h，按蘇木素-伊紅(HE)染色常規(guī)方法進(jìn)行，中性樹膠封片石蠟包埋，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 MOOR激光血流微循環(huán)檢測(cè)

每組末次給藥10 min后，隨機(jī)取5只，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，麻醉后5 min，除空白對(duì)照組皮下給予等量生理鹽水外，其余各組均皮下多點(diǎn)注射ISO，用MOOR激光散斑進(jìn)行心臟表面微循環(huán)掃描，記錄注射5 min后心臟表面30 s內(nèi)的心臟血流情況。以MOOR心肌血流值作為心肌缺血指標(biāo)。

1.3.4 NO含量檢測(cè)

取各組其余的7只大鼠，給藥30 min后， 經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，放置20 min后3 000 r/min離心25 min，分離血清冷凍保存，按ELISA試劑盒說明檢測(cè)NO的含量。

1.3.5 eNOS mRNA表達(dá)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取各組大鼠心肌組織，用RNAiso Plus試劑盒提取心肌組織總RNA，吸光度測(cè)定方法檢測(cè)eNOS mRNA濃度和純度。用ΔΔCT法對(duì)Real-time RT-PCR結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3.6 PI3K、AKT、P-AKT 蛋白表達(dá)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取各組大鼠心肌組織，稱取100 mg放入玻璃勻漿器中，加入1 mL裂解液(蛋白裂解液與PMSF比例為100∶1)，在冰上充分研磨；吸入到預(yù)冷1.5 mL無菌EP管中；12 000 rpm，4 ℃，離心10 min，取上清；BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性后，每孔上樣20 μL，電泳后轉(zhuǎn)膜 3 h，一抗孵育 1 h 后，4℃ 過夜，次日二抗孵育1 h后，暗室中加入ECL發(fā)光液后，曝光 30 min，掃描圖像后分析結(jié)果，目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的光密度比值后，再各組比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，F(xiàn)檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌形態(tài)變化

各組大鼠心肌組織行HE染色后，鏡下可見，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增大；人參皂苷素Rb1低劑量組和高劑量組均改善上述情況，高劑量組效果較顯著。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠心肌形態(tài)(100×)注：A為空白對(duì)照組；B為模型組；C為人參皂苷素Rb1低劑量組；D為人參皂苷素Rb1高劑量組

2.2 各組大鼠心臟表面平均血流灌注量情況

與空白對(duì)照組相比，模型組心肌平均血流量顯著降低(P<0.05)；給予人參皂苷素Rb1后，兩組心肌血流量均顯著增加(P<0.05)；與低劑量組Rb1組相比，高劑量組Rb1組心肌血流量增加較多(P<0.05)。結(jié)果見圖2，表2。

圖2 各組大鼠心肌平均血流量圖注：A為空白對(duì)照組；B為模型組；C為人參皂苷素Rb1低劑量組；D為人參皂苷素Rb1高劑量組

組別n劑量(mg/kg)PU空白對(duì)照組5—546．98±5．06?模型組5—354．73±31．69人參皂苷素Rb1低劑量組510412．33±51．82?人參皂苷素Rb1高劑量組520483．03±79．42?△

注：與模型組比較，*P<0.05；與人參皂苷素Rb1低劑量組比較，△P<0.05

2.3 各組大鼠血清NO含量比較

與空白對(duì)照組相比，模型組血清NO含量顯著降低(P<0.05)；給予人參皂苷素Rb1后，兩組血清NO含量均顯著增加(P<0.05)；與低劑量組相比，高劑量組增加無顯著差異性(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清NO含量比較(Mean±SD)

注：與模型組比較，*P<0.05

2.4 各組大鼠心肌eNOS mRNA表達(dá)

與對(duì)照組相比，模型組心肌eNOS mRNA含量顯著降低(P<0.05)；給予人參皂苷素Rb1后，兩組心肌eNOS mRNA含量均顯著增加(P<0.05)；與低劑量組相比，高劑量組增加無顯著差異性(P>0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠心肌eNOS mRNA表達(dá)情況比較(Mean±SD)

注：與模型組比較，*P<0.05

2.5 PI3K、Akt、P-AKT蛋白表達(dá)情況比較

與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌組織PI3K蛋白表達(dá)及Akt蛋白磷酸化水平明顯減低(P<0.01)；與模型組比較，高劑量組可以顯著提高心肌組織PI3K蛋白表達(dá)及Akt蛋白磷酸化水平(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織PI3K及p-AKT蛋白的表達(dá)情況 注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.05

3 討論

人參一直是我國珍貴的中藥材之一，因其獨(dú)有的藥理活性，被廣泛應(yīng)用于保護(hù)心腦血管、抗衰老等方面。人參皂苷素Rb1是人參中最重要的活性成分之一，現(xiàn)代研究證明其可以有效改善心腦血管系統(tǒng)功能，起到抗心肌細(xì)胞凋亡、保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[9]。而細(xì)胞凋亡通路通常受PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路調(diào)控[10]，AKT通常磷酸化后被激活，磷酸化的AKT(P-AKT)可以通過磷酸化激活eNOS，eNOS是合成NO的關(guān)鍵限速酶，從而調(diào)控NO生成含量，NO在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過程中起到了關(guān)鍵的作用，其可通過激活蛋白激酶C和線粒體ATP敏感性鉀離子通道，改善線粒體功能，抑制線粒體釋放凋亡因子，同時(shí)還具有擴(kuò)張血管、清除氧自由基等重要生理功能，是抗冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的重要因子[11-12]。

本研究顯示，模型組心肌結(jié)構(gòu)紊亂，血流量明顯降低(P<0.05)，表示心肌缺血模型造模成功，模型組血清NO含量以及心肌組織的eNOS mRNA 表達(dá)、PI3K、Akt、P-Akt蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，給予低、高劑量皂苷素Rb1后，心肌結(jié)構(gòu)得到改善，心肌血流量得到明顯改善，且高劑量提高更顯著；NO含量及eNOS mRNA 表達(dá)均顯著高于模型組；PI3K、Akt、P-Akt蛋白表達(dá)增強(qiáng)。這可能是一定濃度的人參皂苷素Rb1對(duì)缺血心肌保護(hù)作用機(jī)制之一，通過結(jié)果可推測(cè)皂苷素Rb1具有一定的保護(hù)心肌作用。

PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路可通過調(diào)控Caspase-3、Bax、Bcl-2等下游通路來控制細(xì)胞凋亡[13]，本研究蛋白結(jié)果顯示，心肌缺血后PI3K、AKT、P-AKT蛋白的表達(dá)降低，而給予低、高劑量的人參皂苷素Rb1后相應(yīng)蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，相比較低劑量組，高劑量組蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)。其很有可能通過PI3K-AKT通路來促進(jìn)eNOS mRNA表達(dá)，增加NO生成，達(dá)到抗心肌缺血保護(hù)心肌的作用。

相關(guān)報(bào)道稱人參皂苷素Rg1在體外實(shí)驗(yàn)研究中可通過 PI3K/Akt 途徑增加 VEGF的表達(dá)，通過 eNOS 途徑增加 NO 的釋放，從而誘導(dǎo)血管再生[14]，很可能皂苷素Rb1可通過PI3K-Akt- eNOS 途徑增加NO的釋放量來誘導(dǎo)心肌缺血血管的再生，其參與抗心肌缺血，抑制心肌細(xì)胞凋亡與自噬通路的作用還需要進(jìn)一步研究。

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