HPLC同時(shí)測(cè)定牛大力中刺桐堿和高麗槐素的含量△

陳明權(quán)，彭富全，何風(fēng)雷，農(nóng)根林

(廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司，廣東 廣州 510288)

牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤M(fèi)illettiaspeciosaChamp.的干燥根[1]，俗稱(chēng)山蓮藕、血藤、九龍串珠、牛古大力、大力薯。牛大力性平味甘，具補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)之功效，臨床證明其對(duì)腰肌勞損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等有一定療效[2]。牛大力為嶺南地區(qū)藥食兩用植物，是舒筋健腰丸、壯腰健腎丸等名優(yōu)產(chǎn)品的重要原料之一?，F(xiàn)代研究表明，牛大力藥材中主要含有刺桐堿、高麗槐素和芒柄花素等化學(xué)成分[3-5]；其中刺桐堿具有增強(qiáng)細(xì)胞毒性、抗焦慮、抗痙攣和DPPH自由基清除作用[6]，高麗槐素具有抗補(bǔ)體作用，對(duì)白血病細(xì)胞(HL-60)和大鼠嗜堿性細(xì)胞白血病細(xì)胞(RBL-2H3)具有細(xì)胞毒活性[7-8]。

陳勇等[9]以芒柄花素和高麗槐素為指標(biāo)成分，建立了測(cè)定牛大力藥材中芒柄花素和高麗槐素含量的方法；但結(jié)果表明，8個(gè)批次的牛大力中芒柄花素的含量均較低(≤0.002%)；因此，該成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)的實(shí)際意義不大。本文首次以刺桐堿和高麗槐素作為指標(biāo)性成分，建立了牛大力藥材中刺桐堿和高麗槐素含量的測(cè)定方法，為牛大力藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜議(美國(guó)安捷倫公司)；Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫公司)；Millpore simplicity-67120型超純水器(美國(guó)密理博公司)；BS110S型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；WXJ型粉碎機(jī)(上海凱旋中藥機(jī)械制造有限公司)；KQ-100DV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

牛大力藥材分別采集或購(gòu)自廣東電白(S1～S2)、云南勐海(S3～S4)、廣州清平中藥材市場(chǎng)(S5～S6)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定為豆科植物美麗崖豆藤M(fèi)illettiaspeciosaChamp.的根。對(duì)照品刺桐堿(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，供含量測(cè)定用，批號(hào)：140428，純度：98%)；高麗懷素(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，供含量測(cè)定用，批號(hào)：131025，純度：98%)；乙腈(Fisher，色譜純)；冰醋酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)；液相用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC色譜條件

色譜柱為Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%冰醋酸水溶液，按程序梯度洗脫(0～12 min，10%乙腈；12～13 min，10%～40%乙腈；13～35 min，40%乙腈)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm(0～13 min)和310 nm(13～35 min)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。在該條件下，混合對(duì)照品及牛大力樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。

注：A.混合對(duì)照品；B.牛大力樣品；1.刺桐堿；2.高麗槐素。圖1 混合對(duì)照品和牛大力樣品HPLC圖

2.2 供試品溶液的制備

取牛大力樣品粉末1.00 g(過(guò)45目篩)，精密稱(chēng)定，置100 mL錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，稱(chēng)定重量，超聲提取40 min，放冷至室溫，補(bǔ)重，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取對(duì)照品刺桐堿7.11 mg、高麗槐素2.17 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為142.2、43.4 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 μL，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，以各成分峰面積Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出刺桐堿和高麗槐素的回歸方程分別為Y=1 231.5X-8.68(r=0.999 9)和Y=1 309.3X-7.24(r=0.999 8)。結(jié)果表明，刺桐堿和高麗槐素的進(jìn)樣量分別在0.284 4～1.422 0 μg和0.087 0～0.435 2 μg與峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積積分值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果刺桐堿的RSD=0.89%，高麗槐素的RSD=1.73%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別在0、3、6、12、24、48 h按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得刺桐堿的RSD=1.37%，高麗槐素的RSD=1.52%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一供試樣品6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析。測(cè)得峰面積積分值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果刺桐堿的RSD=1.42%，高麗槐素的RSD=1.91%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已測(cè)定的牛大力藥材(編號(hào)：S1)粉末1.0 g，共6份，分別精密加入刺桐堿對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為2.04 mg·mL-1)和高麗槐素對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.13mg·mL-1)各1 mL，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣10 μL，注入HPLC色譜儀，測(cè)其峰面積，計(jì)算回收率。刺桐堿平均回收率為99.6%，RSD=1.57%(n=6)，高麗槐素平均回收率為100.9%，RSD=2.18%(n=6)。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 牛大力中刺桐堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 牛大力中高麗槐素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品的測(cè)定

取6批牛大力樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 牛大力樣品中刺桐堿、高麗槐素含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 HPLC色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 流動(dòng)相組成系統(tǒng)的優(yōu)化 考察了甲醇-水、乙腈-水及在流動(dòng)相中添加不同濃度的冰醋酸對(duì)樣品分離的影響，結(jié)果表明采用乙腈-0.1%冰醋酸水溶液對(duì)刺桐堿、高麗槐素成分的分離有明顯改善；采用梯度洗脫較等度洗脫能明顯改善各特征峰的分離效果，既能滿(mǎn)足基線分離的要求，又有適宜的保留時(shí)間；故實(shí)驗(yàn)選用乙腈-0.1%冰醋酸水溶液作為流動(dòng)相并采用梯度洗脫方式。

3.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 HPLC-PDA 分析結(jié)果表明，2個(gè)指標(biāo)成分刺桐堿、高麗槐素最大吸收波長(zhǎng)分別為280、310 nm。因此，選擇280、310 nm分別作為刺桐堿、高麗槐素的檢測(cè)波長(zhǎng)，在兩個(gè)波長(zhǎng)下，表觀峰度高、峰形較好且基線穩(wěn)定。

3.2 藥材提取方法的優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)法考察了超聲提取時(shí)間(40、60、80 min)、提取溶劑(50%、70%、90%乙醇水)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30)對(duì)牛大力藥材中刺桐堿、高麗槐素成分的提取效率，結(jié)果表明，刺桐堿的最佳提取工藝為超聲提取40 min、50%乙醇、料液比(1∶10)，其中料液比“1∶10”與“1∶20”對(duì)刺桐堿含量的影響不存在顯著差異。高麗槐素的最佳提取工藝為超聲提取40 min、50%乙醇、料液比(1∶20)，其中料液比“1∶10”與“1∶20”對(duì)高麗槐素含量的影響存在顯著差異。綜合考慮，牛大力最佳提取工藝選擇為超聲提取40 min、50%乙醇、料液比(1∶20)。

3.3 小結(jié)

測(cè)定了不同來(lái)源的6個(gè)批次的牛大力藥材中刺桐堿和高麗槐素的含量，其藥材的HPLC色譜圖基本一致，但藥材中刺桐堿和高麗槐素含量具有一定差異性。本文建立了以刺桐堿、高麗槐素為指標(biāo)成分的牛大力藥材的含量測(cè)定方法，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，為牛大力藥材質(zhì)量控制提供了新的參考。

[1] 廣東中藥志編輯委員會(huì).廣東中藥志：第一卷[M].廣州：廣東科學(xué)技術(shù)出版社，1994：168.

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