低產(chǎn)桔霉素紅曲霉復(fù)合誘變育種

莊曉曉， 王 鈺， 李闊闊， 沈小瑞

(安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院， 合肥 230601)

紅曲霉是單子囊菌(Monascus)的腐生真菌，其代謝產(chǎn)物有色素[1]、抗生素、洛伐他汀[2]、麥角固醇和γ-氨基丁酸等。洛伐他汀(Lovastatin)是一種膽固醇合成抑制劑，由日本學(xué)者遠(yuǎn)藤章林于1979年在紅色紅曲霉(Monascus.ruber)中發(fā)現(xiàn)。由于其獨(dú)特的療效，目前已被稱為最佳的血脂調(diào)節(jié)物[3]。但洛伐他汀的生產(chǎn)及應(yīng)用被次級代謝產(chǎn)物桔霉素所限制。

桔霉素是由脂類代謝產(chǎn)生的，會對健康造成一系列短期或者長期的影響[4]。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)桔霉素是一種神經(jīng)毒性的真菌毒素，可以使動物致死，并有致畸作用[5]。同時還會引起實(shí)驗(yàn)動物的腎臟腫大、尿量增多、腎小管擴(kuò)張和上皮細(xì)胞變性壞死等癥狀[6-7]。楊建等[8]通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基使桔霉素的含量降低到1051 mg/L。劉穎等[9]通過對不同來源的紅曲樣品分離純化，再結(jié)合固態(tài)發(fā)酵定向篩選，得到一株低產(chǎn)桔霉素菌株NW3-2該菌株桔霉素含量低于最低檢測限16.0 μg/kg。

微生物誘變育種包括物理誘變和化學(xué)誘變。紫外誘變作為物理誘變的一種，其誘變的機(jī)制是紫外輻射影響DNA中堿基的正常配對和雙鏈的解開，從而影響DNA的復(fù)制。復(fù)合誘變一般包括兩種或兩種以上的誘變劑的先后使用，同一種誘變劑的重復(fù)使用和兩種或多種誘變劑的同時使用。一般認(rèn)為復(fù)合誘變具有協(xié)同作用，其效果會比單一誘變效果好。王軒等[10]以紫外誘變結(jié)合化學(xué)誘變的方法，使誘變菌株比原始菌株的桔霉素含量降低了90%以上。

本研究以N+離子束誘變后得到的高產(chǎn)洛伐他汀菌株為出發(fā)菌株，對其再進(jìn)行紫外誘變，以期得到低產(chǎn)桔霉素且洛伐他汀產(chǎn)量相對高而穩(wěn)定的誘變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅曲霉M50-2由安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院資源植物保護(hù)與利用研究組通過N+離子束誘變篩選及保存[13]。

1.1.2 主要試劑和儀器

洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。高效液相色譜儀：Waters；色譜柱：Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)；恒溫恒濕箱：寧波江南儀器廠；搖床：上海知楚儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：100 mL甘油，25 g蛋白胨，2 g NaNO3，2 g ZnSO4·7H2O，1 g MgSO4·7H2O，1 g K2HPO4，1000 mL蒸餾水。液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：100 mL甘油，20 mL玉米漿，10 g硝酸鈉，10 g乙酸鈉，5 g甲硫氨酸，5 g KH2PO4，2 g MgSO4·7H2O，1000 mL蒸餾水。MEA(麥芽提取物)培養(yǎng)基：20 g麥芽提取物，10 g蛋白胨，20 g葡萄糖，15 g瓊脂，1000 mL蒸餾水，pH 5.4。

1.2 方法

1.2.1 桔霉素含量測定

液相色譜條件：色譜柱Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)；熒光檢測器，激發(fā)波長331 nm，發(fā)射波長500 nm，流速1.0 mL/min；等度洗脫流動相比例：甲醇∶純水(磷酸調(diào)pH 4)=55∶45，進(jìn)樣量20 μL，柱溫保持在28℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取1 mg標(biāo)準(zhǔn)品溶解于50 mL甲醇溶液中，配制成20 mg/L溶液。稀釋成濃度為2、4、6、8、10和12 mg/L標(biāo)準(zhǔn)液。

提取方法：2 mL發(fā)酵液，加入4 mL乙醇，60℃水浴1 h，冷卻后，8000 r/min 離心10 min，取上清液用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾。

1.2.2 洛伐他汀含量測定

液相色譜條件：色譜柱Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)；檢測波長238 nm，流速1.0 mL/min；梯度洗脫流動相比例：乙腈∶0.1%磷酸緩沖液(0～6 min, 60∶40；6～24 min, 60～95∶40～5;26～30 min, 95～60∶5～40)進(jìn)樣量10 μL，柱溫保持在35℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取50 mg標(biāo)準(zhǔn)品溶解于10 mL乙腈溶液中，配制成5 mg/mL溶液。吸取2 mL溶液于10 mL容量瓶中，配制成濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，再稀釋成濃度為0.01、0.03、0.05、0.07和0.09 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。

提取方法：2 mL發(fā)酵液，加入6 mL無水乙醇，500 W超聲20 min，70℃水浴2 h，冷卻后，8000 r/min 離心10 min，取上清液用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾。

1.2.3 紅曲霉紫外誘變

將紅曲霉接種于MEA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)7 d。無菌水沖洗并收集孢子懸液于150 mL錐形瓶中，加入無菌玻璃珠，160 r/min，30℃，培養(yǎng)24 h。無菌脫脂棉過濾除去菌絲，孢子濃度稀釋到108個/mL。取5 mL孢子懸液于無菌培養(yǎng)皿中，調(diào)整紫外燈距培養(yǎng)皿距離為30 cm，開啟皿蓋，分別處理30、60、90、120和150 s。誘變后用移液器吸取0.2 mL懸液在紅光下涂布平板，避光培養(yǎng)7～8 d。

1.2.4 高產(chǎn)洛伐他汀低產(chǎn)桔霉素菌株篩選

統(tǒng)計(jì)不同誘變劑量下存活菌落，計(jì)算致死率。分別挑取單菌落于MEA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)7 d。接種菌絲于種子液培養(yǎng)基，160 r/min，30℃培養(yǎng)7 d。將種子液按1∶20比例接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，160 r/min，30℃培養(yǎng)10 d。HPLC法檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素及洛伐他汀含量，篩選具低產(chǎn)桔霉素及高產(chǎn)洛伐他汀性狀菌株。通過連續(xù)傳代培養(yǎng)檢測其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x ± s) 表示。多組間比較采用方差分析; 均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P≤0. 05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同紫外線照射劑量對紅曲霉致死率的影響

計(jì)算孢子懸液在不同紫外線照射時間下的致死率如表1所示，隨著誘變時間的增加而上升，在150 s達(dá)到最大值94.5%。為了提高孢子的誘變率，一般采用較高的致死率，故紫外線照射時間為120～150 s。

2.2 誘變菌株桔霉素含量檢測

紫外誘變后的菌株，液態(tài)發(fā)酵后測定其發(fā)酵產(chǎn)物中桔霉素含量，又根據(jù)其生長情況，篩選得到條件較好的102株紅曲霉菌株，其桔霉素含量如圖1所示，誘變菌株與出發(fā)菌株相對比只有11.7%表現(xiàn)正突變。

表1 誘變劑量對存活率和致死率的影響

2.3 低產(chǎn)桔霉素菌株洛伐他汀的檢測

如圖1所示，篩選得到的102株誘變菌株中13株桔霉素含量較低，相對于起始菌株和其他誘變菌株表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，因此對其進(jìn)行進(jìn)一步的洛伐他汀檢測。結(jié)果如表2所示，M90-22，M90-24，M120-1，M120-32相對于其他菌株具有顯著性差異，雖然這4株菌株之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異，但是M120-1的洛伐他汀產(chǎn)量為0.338 mg/mL，是最高的，所以選擇M120-1為較優(yōu)誘變菌株。

圖 1 誘變菌株桔霉素產(chǎn)量

菌株Strains洛伐他汀產(chǎn)量Lovastatinproduction(mg/mL)M50-20405±0011aM90-150256±0019fgM90-160233±0020gM90-220329±0019bM90-240322±0014bM90-320270±0021efM120-10338±0012bM120-60307±0019bcdM120-80240±0017gM120-90291±0012cdeM120-320330±0015bM150-10314±0013bcM150-120332±0003ab

2.4 目的菌株遺傳穩(wěn)定性

將誘變菌株M120-1連續(xù)培養(yǎng)12代，檢測1、3、6、9和12代的發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素和洛伐他汀產(chǎn)量，以檢測其桔霉素和洛伐他汀產(chǎn)量的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果如表3所示。第6、第9和第12代相對于第1和第3代桔霉素產(chǎn)量略有下降，但6代以后每組之間沒有表現(xiàn)出顯著性差異。子代相對于第1代洛伐他汀產(chǎn)量略有下降，但每組之間以及和一代對比沒有表現(xiàn)出顯著性差異，基本保持產(chǎn)量的穩(wěn)定性。說明該誘變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可以進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

表3 桔霉素和洛伐他汀遺傳穩(wěn)定性

3 討論

在微生物育種領(lǐng)域，隨著一些相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展，利用現(xiàn)代生物技術(shù)如基因工程等來獲得優(yōu)良菌株的研究日益增多，成了育種領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，然而這類研究的實(shí)施卻需要對微生物遺傳背景和次級代謝途徑的深刻了解，但大多數(shù)時候我們并不了解。因此實(shí)際生活中應(yīng)用的還是這些傳統(tǒng)的育種技術(shù)。

利用紫外輻照處理N+離子束誘變得到的高產(chǎn)洛伐他汀菌株，將該菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵后，分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素和洛伐他汀產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著輻照時間的增加，致死率不斷升高，而正突變率先升高后有所降低，這與麻成金等[11]的研究結(jié)果一致，桔霉素的產(chǎn)量逐步減少，說明N+離子束和紫外誘變結(jié)合的復(fù)合誘變，對降低桔霉的產(chǎn)量有較明顯的效果，與此同時，洛伐他汀的產(chǎn)量也相對保持穩(wěn)定，篩選出的紅曲霉突變菌株M120-1，其液態(tài)發(fā)酵桔霉素產(chǎn)量僅為2.15 mg/L，降低顯著，而洛伐他汀產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比相對穩(wěn)定。周建波等[12]利用紫外誘變篩選出了高產(chǎn)紅曲色素菌株，李闊闊等[13]運(yùn)用N+離子束獲得了一株高產(chǎn)洛伐他汀紅曲霉菌株，由此可見，N+離子束誘變和紫外誘變對于紅曲霉誘變育種是一種理想、高效的方法，對紅曲霉的發(fā)展和生產(chǎn)都起到了促進(jìn)的作用，可以推廣使用。

李蕙蕙等[14]使用60Co輻照選育低產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)洛伐他汀紅曲霉株，王軒等[10]使用了紫外和硫酸二乙酯復(fù)合誘變選育低產(chǎn)桔霉素紅曲霉株，胡文效等[15]使用了紫外、LiCl和硫酸二乙酯復(fù)合誘變選育高產(chǎn)洛伐他汀低產(chǎn)桔霉素紅曲霉株，還有通過添加銨鹽等物質(zhì)來研究其對色素及桔霉素的影響。而本實(shí)驗(yàn)選擇紫外和N+離子束復(fù)合誘變，屬于物理誘變，與化學(xué)誘變相比，物理誘變的操作安全性較高、誘變效率較高、對人體及環(huán)境污染較低且更易操作。

而在其中，紫外線能夠作為物質(zhì)被物質(zhì)吸收，所以被廣泛作為微生物誘變劑，其作用機(jī)制最為確定的解釋是紫外線的輻射是DNA分子形成嘧啶二聚體[16]，阻礙堿基配對，并有可能引起突變或死亡[17]。而且，嘧啶二聚體如果形成，還會阻礙雙鏈解開，從而影響DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。所以在N+離子束和紫外復(fù)合誘變下，桔霉素生成過程中的有關(guān)蛋白質(zhì)或酶發(fā)生了變化或轉(zhuǎn)化過程中的中間產(chǎn)物發(fā)生了變化，從而影響了桔霉素的產(chǎn)量，從而我們可以從所有誘變菌株中篩選出低產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)洛伐他汀的誘變菌株。

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