葡萄籽原花青素對奶牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系的影響

楊德蓮 童津津 張 婕 郭 琪 蔣琦暉 蔣林樹* 熊本海

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

葡萄原花青素是葡萄果實(shí)中含有的酚類物質(zhì)，其籽中含量較多[1-3]。它具有抗氧化[4-5]、清除自由基[6]、抗輻射和抗應(yīng)激[7-8]等生物學(xué)作用。其在反芻動物及豬飼養(yǎng)中的添加試驗(yàn)國內(nèi)外均有報道[9-18]。國內(nèi)葡萄籽原花青素對奶牛生產(chǎn)性能方面的影響研究和對羊瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)報道較多[9-14]，而對奶牛瘤胃發(fā)酵及微生物區(qū)系影響的系統(tǒng)研究報道較少，有必要繼續(xù)深入此方面的研究。

目前，通過添加植物皂苷類物質(zhì)來改善家畜生產(chǎn)性能有著廣闊的應(yīng)用前景，尤其在調(diào)控奶牛瘤胃發(fā)酵等方面，成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[19-21]。吳建敏等[9]研究報道，用葡萄渣代替部分玉米、麩皮和豆粕，或者添加適當(dāng)比例的葡萄籽粕飼喂奶牛[10]，對產(chǎn)奶性能、乳品品質(zhì)和日產(chǎn)效益均沒有不良影響，且有利于乳脂率和生產(chǎn)效益的改善。Gessner等[11]用葡萄籽粕替代等比例的苜蓿干草飼喂奶牛提高了奶牛的產(chǎn)奶量和乳脂率，還能降低體細(xì)胞數(shù)。孫占鵬等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂成年羊葡萄渣，羊生產(chǎn)性能和飼料轉(zhuǎn)化效率均有顯著改善。趙棟等[13]研究表明，添加葡萄渣能夠提高綿羊的氮表觀消化率和留存率，能提高綿羊瘤胃液丙酸含量、降低丁酸和乙酸/丙酸對瘤胃液pH的影響。李會菊等[14]在飼糧中添加不同水平的葡萄渣和葡萄籽對成年小尾寒羊平均日增重、粗蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率效果尤為顯著。同時，大量的研究報道發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素還對斷奶仔豬的生產(chǎn)性能、腸道消化酶活性[15]、免疫力[16]、抗氧化能力[17]、繁殖性能[18]等方面均有改善。

綜合來看，目前關(guān)于葡萄籽原花青素調(diào)控奶牛體外發(fā)酵模式的報道較少，尤其是對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系的影響。因此，本試驗(yàn)旨在通過體外法研究葡萄籽原花青素對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系的影響，為葡萄籽原花青素作為調(diào)控奶牛瘤胃發(fā)酵添加劑應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵底物：北京某奶牛養(yǎng)殖場精粗比為40∶60的全混合日糧(TMR)，干物質(zhì)(DM)含量為54.80%，粗蛋白質(zhì)(CP)含量為15.68%，中性洗滌纖維(NDF)含量為39.80%，經(jīng)烘干粉碎過40目篩，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

葡萄籽原花青素：購自天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，含花青素單聚體18.4%，二聚體20.4%，三聚體15.2%，四聚體14.1%，低聚體(5～13個單位)28.5%，酚醛類物質(zhì)4.3%。

緩沖液：試驗(yàn)所用緩沖液按照Menke等[19]的方法配制而成，配制后持續(xù)通入CO2并于39 ℃水浴中保存?zhèn)溆谩?/p>

瘤胃液：選用4頭健康荷斯坦瘺管奶牛，其飼糧精粗比為40∶60(羊草700 g/kg和精料補(bǔ)充料300 g/kg)，晨飼前取瘤胃內(nèi)容物，混合后在39 ℃水浴環(huán)境中經(jīng)4層紗布過濾，裝于保溫瓶迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，操作應(yīng)在盡量短的時間內(nèi)完成[21]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

本試驗(yàn)采用單因素6水平試驗(yàn)設(shè)計，將500 mg發(fā)酵底物置于150 mL厭氧發(fā)酵瓶中，各組葡萄籽原花青素的添加量分別為0(對照)、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg，每組6個重復(fù)。接種時迅速將每個瓶中加入預(yù)熱的緩沖液50 mL和經(jīng)4層紗布過濾的新鮮瘤胃液25 mL，向瓶中持續(xù)通入CO25 s后，立即加上瓶塞，并將每個發(fā)酵瓶與產(chǎn)氣裝置的每個傳感器相連接[22]，于39 ℃下連續(xù)培養(yǎng) 24 h，試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 發(fā)酵底物組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料中含有 One kg of premix contained the following：Cu 800 mg, Mn 1 200 mg,Zn 3 300 mg,Se 30 mg,Co 20 mg,Fe 1 400 mg,I 70 mg,VA 1 100 000 IU,VD 330 000 IU, VE 3 000 IU。

2)產(chǎn)奶凈能為計算值，產(chǎn)奶凈能=0.550 1×消化能-0.094 6[20]，其他營養(yǎng)水平為實(shí)測值。NELwas a calculated value， NEL=0.550 1×DE-0.094 6[20], while other nutrient levels were measured values.

1.3 樣品采集和測定分析

1.3.1 發(fā)酵液樣品采集與處理

待培養(yǎng)管在體外培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)管取出放入冰水浴中使發(fā)酵停止。將培養(yǎng)管中的發(fā)酵液取出，放入至已知質(zhì)量的50 mL塑料離心管，立即測定發(fā)酵液的pH。發(fā)酵液在5 000×g離心10 min，取上清液用于氨態(tài)氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量的測定，具體操作按照嚴(yán)淑紅等[24]的方法。

1.3.2 產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量

使用沈英等[24]研制的AGRS-Ⅲ微生物發(fā)酵微量產(chǎn)氣自動記錄儀測定24 h產(chǎn)氣量。收集發(fā)酵24 h后的氣體，使用安捷倫7890B型號氣相色譜儀測定甲烷產(chǎn)量，色譜儀條件為：TCD檢測器，載氣為氫氣，流量28 mL/min，PorapakQ填充柱，檢測器溫度100 ℃，進(jìn)樣口溫度150 ℃，柱溫38 ℃，進(jìn)樣量1 mL。

1.3.3 總DNA提取和細(xì)菌相對定量

通過珠磨-十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取發(fā)酵液總DNA[25]。實(shí)時定量PCR的引物參照文獻(xiàn)[23]的報道，引物序列見表2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑建立20 μL反應(yīng)體系及反應(yīng)條件[26]，每個樣品3個重復(fù)。根據(jù)qRT-PCR測得的閾值循環(huán)(Ct)和以下公式將目標(biāo)菌含量表示為相對于瘤胃總菌16S rDNA的百分比：目標(biāo)菌含量(%)=100×2-(Ct目標(biāo)菌-Ct總細(xì)菌)[25]。

表2 實(shí)時定量PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件中的one-way ANOVE程序進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行平均值的多重比較。顯著性評判標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 葡萄籽原花青素對發(fā)酵液瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

如表3所示，與對照組相比，添加不同水平的葡萄籽原花青素均顯著提高了發(fā)酵液pH(P<0.05)，其中以0.3 g/kg組的值最高(pH=6.3)(P<0.05)。發(fā)酵液氨態(tài)氮含量的變化范圍為37.29～47.43 mg/dL，0.2 g/kg組的值最低，顯著低于對照組(P<0.05)，0.4 g/kg組的值最高，顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，0.2 g/kg組顯著降低了甲烷產(chǎn)量(P<0.05)；0.3 g/kg組顯著降低了產(chǎn)氣量(P<0.05)。各組發(fā)酵液微生物蛋白含量沒有顯著差異(P>0.05)。

2.2 葡萄籽原花青素對發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

如表4所示，與對照組相比，添加不同水平的葡萄籽原花青素對發(fā)酵液總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、丙酸、戊酸含量及乙酸/丙酸均無顯著影響(P>0.05)。添加0.4和0.5 g/kg的葡萄籽原花青素顯著降低了發(fā)酵液丁酸和異戊酸的含量(P<0.05)。添加0.2 g/kg的葡萄籽原花青素顯著提高了發(fā)酵液異丁酸含量(P<0.05)。

2.3 葡萄籽原花青素對發(fā)酵液微生物含量的影響

如表5所示，與對照組相比，0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg組顯著降低了發(fā)酵液原蟲、溶纖維丁酸弧菌含量(P<0.05)，0.1、0.2、0.4、0.5 g/kg組顯著降低了發(fā)酵液甲烷菌含量(P<0.05)，0.3、0.4、0.5 g/kg組顯著提高了發(fā)酵液真菌含量(P<0.05)，0.1、0.3、0.4、0.5 g/kg組顯著降低了發(fā)酵液產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌含量(P<0.05)。各組發(fā)酵液黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的含量沒有顯著差異(P>0.05)。

表3 葡萄籽原花青素對發(fā)酵液瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母肩標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)， while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)． The same as below.

表4 葡萄籽原花青素對發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

3 討 論

3.1 葡萄籽原花青素對發(fā)酵液瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

氨態(tài)氮是反芻動物瘤胃消化代謝的重要產(chǎn)物，同時也是大部分微生物合成菌體蛋白的原料，其含量直接反映了瘤胃內(nèi)環(huán)境的發(fā)酵情況。在本試驗(yàn)中，適量添加葡萄籽原花青素能夠顯著降低發(fā)酵液氨態(tài)氮的含量。據(jù)報道，瘤胃液氨態(tài)氮含量如果過高，則會經(jīng)瘤胃吸收進(jìn)入血液，加重機(jī)體對氮的代謝負(fù)擔(dān)[27]，不僅造成氮源的浪費(fèi)，動物還易發(fā)生氨中毒。在本試驗(yàn)中，葡萄籽原花青素添加水平為0.2 g/kg時，顯著降低了發(fā)酵液氨態(tài)氮的含量。若含氮物質(zhì)供應(yīng)不足，則微生物生長受阻，動物的生產(chǎn)性能降低；而此時，微生物蛋白的含量也達(dá)到最低值。氨態(tài)氮含量與微生物蛋白含量密切相關(guān)[28]。米熱古麗·伊馬木等[29]報道，通過體外培養(yǎng)法，添加葡萄籽精油可降低發(fā)酵液氨態(tài)氮含量。李沖等[30]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂葡萄渣可顯著減低羔羊的瘤胃液氨態(tài)氮含量。李成云等[31-32]的研究發(fā)現(xiàn)，在體外試驗(yàn)中添加富含縮合單寧的物質(zhì)能夠降低發(fā)酵液中的微生物蛋白含量。Wang等[33]研究表明，在反芻動物飼糧中添加富含縮合單寧物質(zhì)能夠顯著降低瘤胃中蛋白質(zhì)的降解。潘發(fā)明等[34]研究表明，飼糧中的單寧含量越高越則對微生物蛋白的抑制作用就越明顯。有研究報道，體外發(fā)酵液NH3-N含量與產(chǎn)氣量存在高度正相關(guān)(r>0.99)[35]，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致，添加不同水平的葡萄籽原花青素不僅降低了發(fā)酵液氨態(tài)氮的含量，而對產(chǎn)氣量具有抑制作用。邸凌峰等[36]研究發(fā)現(xiàn)，單寧含量與產(chǎn)氣量呈負(fù)相關(guān)。李曉鵬[37]在縮合單寧對體外瘤胃發(fā)酵影響的研究中得出，單寧破壞了瘤胃中部分細(xì)菌的膜，使細(xì)菌不能正常繁殖，同時阻止了酶與底物的結(jié)合，最終影響瘤胃發(fā)酵，導(dǎo)致產(chǎn)氣量降低。

表5 葡萄籽原花青素對發(fā)酵液微生物含量的影響

3.2 葡萄籽原花青素對發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

在反芻動物中VFA作為能量的主要來源，其含量及組成比例直接反映了瘤胃代謝活動水平。瘤胃發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的VFA，主要以乙酸、丙酸、丁酸為主，占TVFA的95%左右，同時，發(fā)酵產(chǎn)生VFA的過程中有能量釋放生成ATP，可被微生物作為能源用于微生物蛋白的合成[38]。本試驗(yàn)中，發(fā)酵液TVFA以及乙酸/丙酸在各組間沒有顯著差異，但是隨著葡萄籽原花青素添加水平的增加，對丁酸的生成具有顯著抑制作用，這與呂忠雷[39]、米熱古麗·伊馬木等[29]、趙棟等[13]的研究結(jié)果相一致。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素對發(fā)酵液異丁酸含量也有顯著的影響。本試驗(yàn)中，發(fā)酵液pH在6.22～6.31，均在正常范圍內(nèi)[38]，對瘤胃微生物的生長無不良影響。該研究結(jié)果與李曉鵬[37]和李成云[32]的研究結(jié)果相似，在體外發(fā)酵試驗(yàn)中，添加富含縮合單寧物質(zhì)能夠提高發(fā)酵液pH。由此可見，葡萄籽原花青素可改變體外瘤胃發(fā)酵模式。

3.3 葡萄籽原花青素對發(fā)酵液微生物含量的影響

本試驗(yàn)中，葡萄籽原花青素顯著降低了發(fā)酵液原蟲及甲烷菌的含量。據(jù)報道，原蟲在瘤胃中主要以細(xì)菌、真菌等為主要捕食對象，其代謝過程中會產(chǎn)生大量的甲烷，與甲烷菌存在共生關(guān)系[40]。因此，有文獻(xiàn)報道指出可以通過驅(qū)除原蟲來減少甲烷菌，進(jìn)而降低甲烷的排放量[41]。王慧玲[42]在體外試驗(yàn)中添加單寧酸及Anantasook等[43]在飼糧添加縮合單寧均發(fā)現(xiàn)顯著降低了瘤胃內(nèi)的原蟲的數(shù)量，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，可能是因?yàn)槠茐牧四撤N原蟲的生活環(huán)境或者是直接作用于原蟲，從而導(dǎo)致原蟲數(shù)量的降低。據(jù)報道，原蟲為甲烷菌提供生長物質(zhì)，而甲烷菌又含有與甲烷生成相關(guān)的輔酶[44]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加葡萄籽原花青素后顯著降低了發(fā)酵液甲烷菌的含量，這與趙薇[45]的研究結(jié)果一致。瘤胃中甲烷的產(chǎn)生大部分是甲烷菌的直接作用結(jié)果，因此減少甲烷菌對于甲烷減排具有重要作用。

在反芻動物瘤胃微生物降解纖維素的作用中真菌和細(xì)菌占主要地位。Wood等[46]通過體外研究表明，瘤胃內(nèi)的真菌對纖維素的降解具有促進(jìn)作用。袁英良[47]研究發(fā)現(xiàn)，在體外試驗(yàn)中添加單寧酸能夠顯著增加瘤胃內(nèi)真菌的數(shù)量。這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似，通過添加葡萄籽原花青素能夠顯著提高發(fā)酵液真菌的含量。研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃真菌分泌的纖維素分解酶的活性較高，但是真菌的繁殖速度較慢，所以細(xì)菌占主導(dǎo)地位[48]。瘤胃細(xì)菌主要包括溶纖維丁酸弧菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌及產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌。溶纖維丁酸弧菌是一種厭氧革蘭氏陽性菌，對于瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)的降解具有重要作用。因其具有蛋白質(zhì)降解酶的活性，當(dāng)飼糧中含有抗性蛋白質(zhì)則酶的活性則被抑制。本試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄籽原花青素顯著降低了溶纖維丁酸弧菌的含量，這與趙薇[45]研究結(jié)果一致，可能是由于葡萄籽原花青素里的縮合單寧是一種植物性的抗性蛋白質(zhì)，同時也可能是因?yàn)榭s合單寧與飼糧中的蛋白質(zhì)結(jié)合形成了復(fù)合物，最終導(dǎo)致溶纖維丁酸弧菌的含量降低。

產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌為一種革蘭氏陰性菌，其纖維素分解活性較高[44]。在純培養(yǎng)的條件下，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌降解能力較強(qiáng)，如能降解結(jié)構(gòu)性堅韌物質(zhì)，還能降解部分黃色瘤胃球菌不能降解的纖維素，且產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌對抗生素具有很強(qiáng)的耐受能力[49]。本試驗(yàn)中，葡萄籽原花青素顯著降低了發(fā)酵液產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的含量。王川[50]報道縮合單寧對產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的細(xì)胞內(nèi)源酶和外源酶均具有強(qiáng)烈的抑制作用，所以減少了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

反芻動物瘤胃內(nèi)的瘤胃球菌主要有黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌，在纖維素分解中起主要作用。黃色瘤胃球菌與白色瘤胃球菌之間既有協(xié)同作用也有抑制作用，白色瘤胃球菌可產(chǎn)生多種細(xì)菌素，并且所產(chǎn)生的這些細(xì)菌素對黃色瘤胃球菌的生長具有抑制作用[51]。李大彪等[52]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加單寧可顯著降低山羊瘤胃液白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌含量。然而，本試驗(yàn)添加葡萄籽原花對發(fā)酵液黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌菌沒有顯著的影響，這可能由于體內(nèi)復(fù)雜的瘤胃內(nèi)環(huán)境與體外試驗(yàn)條件的差異所致。

4 結(jié) 論

① 葡萄籽原花青素可提高發(fā)酵液pH，但均在正常生理范圍之內(nèi)；適宜添加水平的葡萄籽原花青素可降低發(fā)酵液NH3-N含量、提高發(fā)酵液異丁酸含量、降低產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量，超過0.2 g/kg時會促進(jìn)NH3-N的釋放及抑制丁酸和異戊酸生成；葡萄籽原花青素對發(fā)酵液總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、丙酸、戊酸含量及乙酸/丙酸均無顯著影響。

② 葡萄籽原花青素可降低發(fā)酵液中原蟲、甲烷菌、溶纖維丁酸弧菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌含量；葡萄籽原花青素對發(fā)酵液黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌無顯著影響。

③ 綜合認(rèn)為，在奶牛瘤胃體外發(fā)酵條件下，葡萄籽原花青素的適宜添加水平為0.2 g/kg。

[1] PRIEUR C,RIGAUD J,CHEYNIER V,et al.Oligomeric and polymeric procyanidins from grape seeds[J].Phytochemistry,1994,36(3):781-784.

[2] 黃藝寧.葡萄原花青素研究及其ANR基因的克隆[D].碩士學(xué)位論文.福州:福建農(nóng)林大學(xué),2008.

[3] 萬本屹,李宏,董海洲.葡萄籽原花青素提取及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2002(2):43-45.

[4] VITSEVA O,VARGHESE S,CHAKRABATI S,et al.Grape seed and skin extracts alter platelet function and release of reactive oxygen species[J].Journal of the American College of Cardiology,2004,43(Suppl.2):A518.

[5] 尹進(jìn),胡怡秀,胡余明,等.葡萄籽原花青素提取物對小鼠MDA、SOD和GSH-Px的影響[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2007,7(8):1285-1286.

[6] BAYATLI F,AKKUS D,KILIC E,et al.The protective effects of grape seed extract on MDA,AOPP,apoptosis and eNOS expression in testicular torsion:an experimental study[J].World Journal of Urology,2013,31(3):615-622.

[7] CHARRADI K,EIKAHOUI S,KARKOUCH I,et al.Grape seed and skin extract alleviates high-fat diet-induced renal lipotoxicity and prevents copper depletion in rat.[J].Applied Physiology,Nutrition,and Metabolism,2013,38(3):259-267.

[8] 劉相菊,高海青,邱潔,等.葡萄籽原花青素對兔動脈粥樣硬化氧化應(yīng)激的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2010,48(8):25-27.

[9] 吳建敏,承堯興,徐俊,等.葡萄籽殘渣飼喂奶牛的效果研究[J].中國畜牧雜志,2007,43(7):62-63.

[10] 杜道全,楊文華.葡萄籽粕在奶牛日糧中的應(yīng)用研究[J].河南畜牧獸醫(yī):綜合版,2009,30(8):28-29.

[11] GESSNER D K,WINKLER A,KOCH C,et al.Analysis of hepatic transcript profile and plasma lipid profile in early lactating dairy cows fed grape seed and grape marc meal extract[J].BMC Genomics,2017,18(1):253.

[12] 孫占鵬,王曦,李會菊,等.日糧中添加不同劑量葡萄渣對成年羊增重效果的影響[J].中國草食動物科學(xué),2010,30(1):46-48.

[13] 趙棟,鄭琛,李發(fā)弟,等.葡萄渣單寧對綿羊養(yǎng)分消化代謝及瘤胃發(fā)酵的影響[J].草業(yè)學(xué)報,2014,23(4):285-292.

[14] 李會菊,孫占鵬.日糧中添加葡萄渣對小尾寒羊成年母羊體重的影響[J].飼料工業(yè),2010,31(3):33-36.

[15] 解玲娜,茅婷婷,劉暢,等.葡萄籽原花青素對斷奶仔豬消化道酶活、內(nèi)臟相對重量及血細(xì)胞參數(shù)的影響[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2012,27(4):13-15.

[16] 趙家奇,郝瑞榮,高俊杰,等.葡萄籽原花青素對斷奶仔豬免疫力和抗氧化功能的影響[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2016,36(10):735-739.

[17] 趙嬌,周招洪,梁小芳,等.葡萄籽原花青素及維生素E對氧化應(yīng)激仔豬生長性能、血清氧化還原狀態(tài)和肝臟氧化損傷的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(19):4157-4164.

[18] 劉海燕,于維,蘇秀俠,等.葡萄籽飼喂生長育肥豬的飼養(yǎng)試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2008(11):35-36.

[19] MENKE K H,STEINGASS H．Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis andinvitrogas production using rumen fluid[J].Animal Research Development,1988,28(1) :7-55．

[20] 馮仰廉,陸治年.奶牛營養(yǎng)需要和飼料成分[M].3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2007.

[21] 周敏,葉子弘,蔣林樹.瘤胃氫化多不飽和脂肪酸的影響因素[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2010,26(8):38-44.

[22] 潘龍,牛俊麗,卜登攀,等.柴胡皂苷對體外發(fā)酵參數(shù)及細(xì)菌數(shù)量變化的影響[J].草業(yè)學(xué)報,2015,24(6):85-91.

[23] 嚴(yán)淑紅,趙士萍,蔣琦暉,等.茶皂素對奶牛瘤胃發(fā)酵及瘤胃微生物區(qū)系的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2016,28(8):2485-2496.

[24] 沈英,宋正河,楊紅建,等.基于虛擬儀器技術(shù)的飼料體外發(fā)酵產(chǎn)氣自動記錄系統(tǒng)的研制[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2006,22(12):159-163.

[25] BüRGMANN H,PESARO M F,WIDMER F,et al.A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil[J].Journal of Microbiological Methods,2001,45(1):7-20.

[26] 劉薇,辛杭書,劉彩娟,等.海南霉素對瘤胃發(fā)酵模式、甲烷生成和微生物區(qū)系的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2012,43(2):242-249.

[27] COTTA M A,RUSSELL J B.Effect of peptides and amino acids on efficiency of rumen bacterial protein synthesis in continuous culture[J].Journal of Dairy Science,1982,65(2):226-234.

[28] SRINIVAS B,GUPTA B N.Rumen fermentation,bacterial and total volatile fatty acid (TVFA) production rates in cattle fed on urea-molasses-mineral block licks supplement[J].Animal Feed Science & Technology,1997,65(1/2/3/4):275-286.

[29] 米熱古麗·伊馬木,余雄,王改琴,等.葡萄籽精油對體外瘤胃發(fā)酵和甲烷生成的影響[J].畜牧與獸醫(yī),2012,44(1):4-7.

[30] 李沖,王宏博,李發(fā)弟,等.葡萄渣對羔羊瘤胃微生物區(qū)系和發(fā)酵功能的影響[J/OL].北京:中國科技論文在線(2017-04-14).http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201704-235.

[31] 李成云,袁英良,樸光一.縮合單寧對瘤胃揮發(fā)性脂肪酸及微生物生長的影響[J].飼料研究,2010(11):5-7.

[32] 李成云,袁英良,劉彩紅.體外法研究榛子葉提取縮合單寧對蛋白質(zhì)消化及瘤胃發(fā)酵的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2010(17):103-104.

[33] WANG Y,BARBIERI L R,Berg B P,et al.Effects of mixing sainfoin with alfalfa on ensiling,ruminal fermentation and total tract digestion of silage[J].Animal Feed Science and Technology,2007,135(3/4):296-314.

[34] 潘發(fā)明,王彩蓮,劉隴生,等.單寧在反芻動物飼料中的應(yīng)用前景[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40(5):222-225.

[35] 孟慶翔,張洪軍,戎易,等.估測飼料蛋白質(zhì)瘤胃降解率活體外新方法的研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1991,4(4):95-101.

[36] 邸凌峰,曹雪,秦?zé)樫?等.兩種含單寧飼草對反芻動物應(yīng)用的價值研究[J].飼料工業(yè),2017,38(7):43-50.

[37] 李曉鵬.縮合單寧對體外發(fā)酵特性的影響[D].碩士學(xué)位論文.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[38] 馮仰廉.反芻動物營養(yǎng)學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2004.

[39] 呂忠蕾.不同分子量縮合單寧對延邊黃牛瘤胃發(fā)酵及微生物區(qū)系的影響[D].碩士學(xué)位論文.延吉:延邊大學(xué),2014.

[40] RUSSI J P,WALLACE R J,NEWBOLD C J.Influence of the pattern of peptide supply on microbial activity in the rumen simulating fermenter (RUSITEC)[J].British Journal of Nutrition,2002,88(1):73-80.

[41] 陳丹丹,刁其玉,姜成鋼,等.反芻動物甲烷的產(chǎn)生機(jī)理和減排技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國草食動物科學(xué),2012,32(4):66-69.

[42] 王慧玲,王小平,尕藏桑智,等.單寧酸對綿羊瘤胃體外發(fā)酵和甲烷產(chǎn)量的影響[J].中國草食動物科學(xué),2013,33(6):46-48.

[43] ANANTASOOK,王聰,晉大鵬.日糧添加含單寧和皂苷的雨樹莢對奶牛瘤胃發(fā)酵和甲烷產(chǎn)量調(diào)控的影響[J].中國畜牧獸醫(yī),2014,41(2):152-152.

[44] GARCIA J L,PATEL B K C,OLLIVIER B.Taxonomic,phylogenetic,and ecological diversity of methanogenic archaea[J].Anaerobe,2000,6(4):205-226.

[45] 趙薇.中草藥飼料添加劑對陜北白絨山羊生產(chǎn)性能和糞尿及甲烷排放的影響[D].碩士學(xué)位論文.楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2014.

[46] WOOD T M,WILSON C A,MCCRAE S I,et al.A highly active extracellular cellulase from the anaerobic rumen fungusNeocallimastixfrontalis[J].Fems Microbiology Letters,1986,34(1):37-40.

[47] 袁英良.日糧中添加縮合單寧對瘤胃發(fā)酵及飼料消化率的影響[D].碩士學(xué)位論文.延吉:延邊大學(xué),2010.

[48] 陳小連,劉建新,王佳堃,等.瘤胃纖維分解菌多纖維素酶體及其類似物的研究進(jìn)展[J].中國畜牧雜志,2009,45(3):50-53.

[49] 劉占英.綿羊瘤胃主要纖維降解細(xì)菌的分離鑒定及不同氮源對其纖維降解能力的影響[D].博士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[50] 王川.葡萄籽單寧的抗氧化性研究[J].食品科技,2009,34(2):184-187.

[51] 焦萬洪,李莉.牛瘤胃內(nèi)主要細(xì)菌結(jié)構(gòu)與功能探查[J].中國畜禽種業(yè),2016,12(2):84.

[52] 李大彪,張梅梅,于永強(qiáng),等.單寧和聚乙二醇對綿羊和山羊瘤胃纖維降解菌數(shù)量的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2015,27(2):596-605.