東北地區(qū)動(dòng)物源糞腸球菌耐藥性監(jiān)測(cè)與分析

李延山，李欣南，韓鐫竹，高 鐸，武鳳嬌

（1.遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽(yáng) 110003；2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，遼寧 沈陽(yáng)110016）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫陰性球菌，是人和動(dòng)物腸道內(nèi)主要菌群之一[1]，占腸道菌群的82%～87%[2]，具有重要的生理功能。其能產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，抑制大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等病原菌的生長(zhǎng)，改善腸道微環(huán)境[3]；還能抑制腸道內(nèi)產(chǎn)尿素酶細(xì)菌和腐敗菌的繁殖，減少腸道尿素酶和內(nèi)毒素的含量，使血液中氨和內(nèi)毒素的含量下降[4]。農(nóng)業(yè)部在2008年公布的第1126號(hào)公告《飼料添加劑品種目錄》中將其列為允許在飼料中添加的益生菌種類(lèi)[5]。但在發(fā)揮作用的同時(shí)，糞

1.1 菌株來(lái)源糞腸球菌質(zhì)控菌株為ATCC29212，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；豬肛門(mén)或雞泄殖腔棉拭子來(lái)源于肉雞和生豬養(yǎng)殖場(chǎng)（戶(hù)）。腸球菌也是一種條件致病菌[6]。在動(dòng)物中，常見(jiàn)糞腸球菌引發(fā)狗的外耳炎[7]，家禽的敗血癥和心內(nèi)膜炎[8-9]及仔豬的關(guān)節(jié)炎和敗血癥[10]等。本文借鑒選擇分離、生化鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)等方法[11-12]，通過(guò)分析東北地區(qū)健康動(dòng)物中糞腸球菌的耐藥性變化趨勢(shì)，為臨床糞腸球菌的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.2 儀器生物安全柜CLASSⅡ（美國(guó)NUAIRE公司）、全自動(dòng)高壓滅菌器（日本三洋電器集團(tuán)）、恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)BINDER公司）、ABT Expression鑒定儀（BIOMERIEUX公司）。

1.3 培養(yǎng)基與材料運(yùn)送培養(yǎng)基、腸球菌肉湯培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；API NaCl 0.85%培養(yǎng)基、rapid ID 32 STREP鑒定條均購(gòu)自BIOMERIEUX公司；腸球菌藥敏檢測(cè)板購(gòu)自天津市金章科技發(fā)展有限公司。

1.4 方法

1.4.1 采樣用滅菌棉簽采集動(dòng)物肛門(mén)和泄殖腔樣品，置入運(yùn)送培養(yǎng)基中0～4℃保存。

1.4.2 分離純化將拭子樣品直接接入腸球菌肉湯中，36±1℃培養(yǎng)48 h。挑取預(yù)增菌培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種于糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基36±1℃培養(yǎng)48 h。將疑似菌株接種于哥倫比亞血瓊脂上36±1℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.4.3 生化鑒定將上述獲得的疑似單菌落，在哥倫比亞血瓊脂平板上劃線(xiàn)純化培養(yǎng)不超過(guò)24 h。將待檢細(xì)菌單個(gè)菌落，懸浮于3 mL懸浮培養(yǎng)基，制備4.0麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，使用自?dòng)加樣器將菌懸液滴入試紙條反應(yīng)杯中，每個(gè)反應(yīng)杯中滴入55 μL，菌液和試劑滴加完畢后，37℃培養(yǎng)4小時(shí)，用細(xì)菌鑒定儀判讀。

1.4.4 藥物敏感性試驗(yàn)用接種環(huán)挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)1～18小時(shí)的3～5個(gè)單菌落，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝?。取M-H肉湯稀釋至5×105CFU/mL濃度的菌液0.1 mL分別加入含系列抗菌藥物溶液的板中，混勻，試管中最終抗菌藥物的濃度為原稀釋濃度的一半。將加有菌液和抗菌藥物的板，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。取出培養(yǎng)后的板，觀察結(jié)果，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低抗菌藥物溶液的濃度為最低抑菌濃度（MIC）。在質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度符合規(guī)定范圍的前提下，按判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷被檢菌株的敏感性—敏感（S），中度敏感（I）或耐藥（R），判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)。

2.1 分離純化結(jié)果采集了東北地區(qū)26個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的豬肛門(mén)或雞泄殖腔棉拭子共780份樣品，分離鑒

2 結(jié)果與分析

定得到289株糞腸球菌，分離率為37.05%。在腸球菌肉湯中，培養(yǎng)后混濁變黑為疑似菌株，仍保持澄清透明、棕褐色為陰性，具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 腸球菌肉湯中的生長(zhǎng)情況Fig.1 The growth condition of Enterococcus broth

糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上帶棕色環(huán)的棕黑色菌落，邊緣光滑沒(méi)有白色潤(rùn)圈的為疑似單菌落，白色菌落為其他菌株，結(jié)果見(jiàn)圖2。最終在哥倫比亞血瓊脂上菌落圓形、純白色，表面凸起濕潤(rùn)，有光澤，邊緣整齊的菌落確定為陽(yáng)性糞腸球菌，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 陽(yáng)性糞腸球菌在糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)Fig.2 The growth pattern of positive Enterococcus faecalis in the agar medium of Enterococcus faecalis

圖3 糞腸球菌在哥倫比亞血瓊脂上的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.3 The growth state of Enterococcus faecalis on Columbia blood agar

2.2 鑒定結(jié)果經(jīng)細(xì)菌鑒定儀判讀后得到的糞腸球菌生化鑒定，與中國(guó)微生物菌種目錄給出的糞腸球菌一致。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 糞腸球菌的耐藥率和MIC分布根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，將最小抑菌濃度minimum inhibitory concentration，MIC）分布列于表1。

總體來(lái)說(shuō)，糞腸球菌對(duì)13類(lèi)測(cè)試抗生素普遍耐藥，豬源糞腸球菌和雞源糞腸球菌的耐藥狀況沒(méi)有明顯區(qū)別，均對(duì)截短側(cè)耳素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和林可胺類(lèi)高度耐藥，對(duì)萬(wàn)古霉素高度敏感。

豬源糞腸球菌對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、磺胺異噁唑、截短側(cè)耳素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和林可胺類(lèi)藥物耐藥率均大于90.0%；對(duì)氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和氯霉素類(lèi)耐藥率介于30.0%～80.0%之間，MIC也主要分布在耐藥的區(qū)域；對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)復(fù)合物、唑烷酮類(lèi)和萬(wàn)古霉素相對(duì)敏感，耐藥率小于10.0%，多數(shù)菌株MIC仍然分布在敏感區(qū)域。

雞源糞腸球菌對(duì)頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、磺胺異噁唑、截短側(cè)耳素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和林可胺類(lèi)藥物耐藥率均大于88.0%；對(duì)四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氯霉素類(lèi)、復(fù)方新諾明耐藥率介于30.0%～70.0%之間，MIC也主要分布在耐藥的區(qū)域；對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)和萬(wàn)古霉素相對(duì)敏感，耐藥率小于10.0%，多數(shù)菌株MIC仍然分布在敏感區(qū)域。

表1 東北地區(qū)豬、雞源糞腸球菌耐藥率及MIC分布情況Table 1 The resistance rate of Enterococcus faecalis and MIC distribution of Pig and chicken source in Northeast China

表1 東北地區(qū)豬、雞源糞腸球菌耐藥率及MIC分布情況（續(xù)）

2.3.2 糞腸球菌的EUCAST分布 將得到的MIC分布結(jié)果與歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（European Committee Antimicrobial Susceptibility Testing， EUCAST）進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，代表藥物MIC分布整體相對(duì)集中，變化不大，相對(duì)于EUCAST的MIC整體水平右移，MIC在增大，導(dǎo)致耐藥率增高。

2.3.3 多重耐藥性狀況 本文中的多重耐藥均是以藥物類(lèi)別來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?？傮w來(lái)看，不同動(dòng)物來(lái)源的菌株多重耐藥率沒(méi)有明顯差異，4類(lèi)及4類(lèi)以上糞腸球菌耐藥菌株占98.61%；10類(lèi)糞腸球菌耐藥株占1.73%，未見(jiàn)全部耐藥菌株（見(jiàn)圖5）。

圖4 東北地區(qū)豬、雞源腸球菌代表藥物的MIC分布圖Fig.4 The MIC distribution of Enterococcus drug representatives of Pig and chicken in Northeast China

圖5 東北地區(qū)豬、雞源腸球菌多重耐藥折線(xiàn)圖Fig.5 Multiple resistance line diagram of Enterococcus source of Pig and chicken in Northeast China

3 討論

本文對(duì)東北地區(qū)的動(dòng)物源糞腸球菌進(jìn)行了耐藥性監(jiān)測(cè)，藥敏試驗(yàn)表明分離獲得的糞腸球菌對(duì)臨床常用的多種抗菌藥物有較高的耐藥率，耐藥率較高的幾種常見(jiàn)抗生素依次為頭孢菌素類(lèi)、磺胺異噁唑、截短側(cè)耳素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和林可胺類(lèi)藥。這幾類(lèi)抗菌藥物中，一些耐藥性是天然耐藥，例如頭孢菌素類(lèi)；一些是獲得性耐藥，例如磺胺類(lèi)，說(shuō)明該類(lèi)抗菌素用藥壓力嚴(yán)重，若繼續(xù)使用不但增加治療預(yù)防成本，也會(huì)誘發(fā)耐藥性的進(jìn)一步遷移，因此，臨床用藥應(yīng)參考耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行合理調(diào)整，降低耐藥性的產(chǎn)生。

在我國(guó)，耐萬(wàn)古霉素腸球菌感染的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，耐萬(wàn)古霉素腸球菌是臨床重要病原菌之一，通過(guò)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在東北地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素的糞腸球菌，應(yīng)持續(xù)監(jiān)測(cè)及時(shí)預(yù)警。

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