H1N1亞型三個(gè)譜系豬流感病毒RT-PCR鑒別診斷方法的建立

蘭德松

（遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽(yáng) 110164）

豬流感（Swine influenza，SI）是由正黏病毒科A型流感病毒屬的豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）感染豬引起的一種高度接觸性呼吸道傳染病，發(fā)病率高、傳播迅速、但死亡率較低[1]。SI作為豬其他疾病的一種重要的誘因之一，在規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)中普遍存在，難以根除。除SIV單獨(dú)感染造成的直接損失外，由于SIV感染導(dǎo)致呼吸道上皮細(xì)胞損傷，感染豬易繼發(fā)感染或混合感染其他細(xì)菌或病毒病，使疫情變得更為復(fù)雜，死亡率升高[2-3]。目前，SI已在世界大部分國(guó)家廣泛存在并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，是目前危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疾病之一。更重要的是，由于豬呼吸道上皮細(xì)胞中有SA-α-2、6-Gal和SA-α-2，3-Gal兩種受體，導(dǎo)致豬對(duì)SIV、禽流感病毒和人流感病毒均易感，多種類(lèi)型的流感毒株可在豬體內(nèi)發(fā)生基因重配產(chǎn)生新的毒株，因此豬被認(rèn)為是流感病毒重組的“混合器”及產(chǎn)生新亞型毒株的活載體[4-6]，鑒于SI在禽流感和人流感的流行、傳播和流感病毒分子變異中的特殊作用，因而其公共衛(wèi)生學(xué)意義重大。目前，在世界范圍內(nèi)引起SI的主要有H1N1、H1N2和H3N2三種亞型SIV[7-8]。其中，H1N1亞型SIV為豬群中SIV感染的優(yōu)勢(shì)亞型毒株，H1N1亞型SIV又分為古典型、類(lèi)人型、類(lèi)禽型和2009年在人群中大流行的甲型H1N1 4個(gè)譜系[8-9]，其中，又以古典型、類(lèi)禽型和甲型H1N1三個(gè)譜系感染較為普遍，危害較大。目前SI在我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)中已經(jīng)廣泛存在，SI的診斷與防制已成為我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)面臨的重大問(wèn)題，SI的有效防控對(duì)控制豬群感染其他細(xì)菌或病毒同樣具有重要意義、同時(shí)能促進(jìn)人流感和禽流感的有效防控。本研究建立H1N1亞型古典型、類(lèi)禽型和甲型三個(gè)譜系的SIV的鑒別診斷方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)H1N1亞型SIV不同譜系的快速、準(zhǔn)確的鑒別診斷，進(jìn)而為政府部門(mén)和養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)有針對(duì)性地采取綜合防控措施提供有力技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株、血清及核酸古典型、類(lèi)禽型和甲型H1N1三個(gè)譜系H1N1亞型SIV由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，不同亞型SIV標(biāo)準(zhǔn)抗原和血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感參考實(shí)驗(yàn)室提供；H5、H7和H9亞型流感病毒核酸為匹基生物試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照。

1.2 主要試劑及儀器核酸提取試劑（適用于提取病毒DNA/RNA）為天隆科技有限公司產(chǎn)品；TAE電泳緩沖液、溴化乙錠、DL 2000 DNA Marker、RNA酶抑制劑（RNase Inhibitor）（40 U/μL、dNTP（2.5 mmol/L）、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（5 U/μL）、DTT（0.1 mmol/L）、Premix EX Taq等為寶生物（大連）有限公司（TaKaRa）產(chǎn)品；低溫高速離心機(jī)為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；C1000 PCR擴(kuò)增儀、BIORAD-3000電泳儀和Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.3 臨床樣品的采集與前處理豬鼻咽拭子和肺臟等臨床樣品，采自遼寧省不同地區(qū)豬場(chǎng)和豬屠宰場(chǎng)（采集鼻咽拭子樣本）。

豬鼻咽拭子的采集與前處理：用病毒采集管采取臨床疑似豬流感活體豬的鼻腔和咽喉拭子，編號(hào)備用，待檢；豬肺臟樣本的采集與前處理：采取病死豬的肺臟，稱(chēng)取1 g肺臟組織進(jìn)行研磨，然后加入1 mL滅菌PBS，混勻，3 000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中編號(hào)備用，待檢。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)甲型、古典型及類(lèi)禽型H1N1亞型不同譜系SIV的血凝素（Haemagglutinin，HA）基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)3套引物（表1），參考序列GenBank收錄號(hào)分別為：GQ259909、FJ789832和JQ319648，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.5 病毒RNA提取及RT-PCR方法的建立按照核酸提取試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒RNA的提取，并用Uni12：5′-AGCAAAAGCAGG-3′引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系（25 μL）如下：DEPC處理的水 11.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，Uni1（220 μmol/L）1 μL，DTT（0.1 mmol/L）2.5 μL，5×Reverse Transcriptase XL Buffer 5 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，總RNA 2 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：反應(yīng)體系混勻后，37℃，水浴1 h；70℃，水浴15 min；反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA直接用于PCR或-20℃保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^(guò)正交試驗(yàn)對(duì)PCR的引物終濃度、模板濃度等反應(yīng)要素條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)梯度試驗(yàn)對(duì)引物退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 RT-PCR方法的特異性試驗(yàn)應(yīng)用本試驗(yàn)建立的RT-PCR方法分別對(duì)甲型、古典型及類(lèi)禽型H1N1亞型不同譜系SIV核酸及H5、H7和H9亞型流感病毒、CSFV及PRRSV核酸進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，驗(yàn)證方法的可靠性及其特異性。

1.7 RT-PCR方法的敏感性試驗(yàn)分別對(duì)甲型、古典型及類(lèi)禽型H1N1亞型三種譜系SIV的核酸進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)龠M(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，各取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠孔中進(jìn)行電泳鑒定。

1.8 RT-PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室不同人員平行提取甲型、古典型及類(lèi)禽型H1N1亞型SIV的總RNA，重復(fù)進(jìn)行3次RT-PCR反應(yīng)，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。

1.9 RT-PCR方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)將采集的460份豬鼻咽拭子樣品接種雞胚，收取尿囊液，進(jìn)行血凝和血凝抑制試驗(yàn)（HA-HI），鑒定亞型；應(yīng)用本試驗(yàn)建立的RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，比較方法之間的符合率。

2 結(jié)果

2.1 PCR條件優(yōu)化的結(jié)果確定PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：Premix EX Taq，12.5 μL；滅菌蒸餾水10.5 μL；上、下游特異性PCR引物（10 μmol/L），各0.5 μL；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，1 μL。最終確定擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃，3 min；94℃，30 s，54℃，30 s，72℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃7 min。

圖1 H1N1三個(gè)譜系SIV RT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The specificity test results of RT-PCR of three sublineage of H1N1 Subtype SIV

圖2 H1N1三個(gè)譜系RT-PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The sensitivity test results of RT-PCR of three sublineages of H1N1 Subtype SIV

2.2 特異性試驗(yàn)試驗(yàn)表明，甲型H1N1、古典型H1N1和類(lèi)禽型H1N1 RT-PCR方法均能特異性地檢測(cè)出相應(yīng)的SIV核酸，分別在476、293和997 bp位置出現(xiàn)特異性條帶，而與其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng)（見(jiàn)圖1）；用本試驗(yàn)建立的RT-PCR方法對(duì)雞胚分離的陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果與尿囊液的病毒亞型鑒定結(jié)果一致；同時(shí)分別回收純化3個(gè)不同譜系的目的片段，送上海生工生物公司進(jìn)行序列測(cè)定，然后應(yīng)用DNA-star軟件分析其同源性，結(jié)果測(cè)定序列與參考序列同源性達(dá)99%以上，表明該方法具有良好的特異性。

2.3 RT-PCR方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果表明，甲型和古典型H1N1亞型SIV RT-PCR可檢測(cè)出稀釋至10-5的模板cDNA（見(jiàn)圖2A、B），類(lèi)禽型H1N1 RT-PCR方法可檢測(cè)出稀釋至10-6的模板cDNA（見(jiàn)圖2C）；利用分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度，按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第三版）中的方法換算成拷貝數(shù)，結(jié)果：甲型H1N1、古典型H1N1和類(lèi)禽型H1N1 RT-PCR方法可檢測(cè)的極限拷貝量分別為1 896、1 655和1 459拷貝/μL SIV核酸。

2.4 RT-PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果3次平行提取甲型、古典型及類(lèi)禽型H1N1亞型SIV陽(yáng)性樣品的總RNA進(jìn)行了RT-PCR重復(fù)性檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有良好的重復(fù)性（見(jiàn)圖3）。

2.5 RT-PCR方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)460份鼻咽拭子經(jīng)雞胚接種后用HA-HI方法鑒定，結(jié)果：甲型H1N1 SIV陽(yáng)性3份、類(lèi)禽型H1N1 SIV陽(yáng)性6份、古典型H1N1 SIV未檢測(cè)到,陽(yáng)性率分別為0.65%、1.30%、0%；本試驗(yàn)建立的H1N1亞型3譜系RT-PCR方法對(duì)尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與HA-HI檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為100%。

圖3 H1N1三個(gè)譜系SIV RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The sensitivity test results of RT-PCR of three sublineages of H1N1 Subtype SIV

3 討論

在1918年人流感暴發(fā)期間，北美豬群中首例SI被報(bào)道，Shope等人于1930年首次分離并鑒定了SIV，命名為“古典型H1N1”（Classical Swine H1N1,CS H1N1）SIV，該型SIV在北美和亞洲國(guó)家一直流行，直到1976年通過(guò)從美國(guó)引種而傳到意大利，隨后傳遍整個(gè)歐洲，直到1979年，歐洲豬群僅發(fā)現(xiàn)單一感染CS H1N1 SIV。隨后，在1979年，相繼在歐洲的比利時(shí)和德國(guó)分離到抗原性與遺傳性與CS H1N1有顯著差異的SIV，被命名為“歐亞類(lèi)禽型豬 H1N1”（Eurasianavian-likeswineH1N1,EA H1N1），該型SIV迅速傳遍整個(gè)歐洲，并取代CS H1N1 SIV成為豬群中的優(yōu)勢(shì)毒株[4,10-11]。管毅等[12]于1996年首次報(bào)道在我國(guó)的南方部分省份豬群中分離到類(lèi)禽型H1N1亞型SIV，經(jīng)遺傳進(jìn)化分析表明，分離株位于EA H1N1大分支內(nèi)，但形成一個(gè)獨(dú)立的亞洲分支譜系。近年來(lái)的監(jiān)測(cè)表明，類(lèi)禽型H1N1 SIV已成為我國(guó)豬群中的優(yōu)勢(shì)毒株。另外，據(jù)Qi等[13]、Wang等[14]報(bào)道，相繼于2011年在中國(guó)江蘇、2012年在中國(guó)河北各一名患嚴(yán)重肺炎死亡的3歲男童體內(nèi)分離到H1N1亞型流感病毒株，通過(guò)遺傳分析表明，分離株與中國(guó)豬群中流行的類(lèi)禽型H1N1亞型和歐洲流行的EA H1N1亞型SIV在抗原性和遺傳性方面密切相關(guān)，可能為SIV直接感染人而在人體內(nèi)適應(yīng)的結(jié)果，表明了類(lèi)禽型H1N1亞型流感病毒具備跨種間傳播的能力[15]。2009年爆發(fā)的甲型H1N1流感疫情，起初被報(bào)道為“SI”疫情，經(jīng)過(guò)遺傳分析表明，該型病毒為三源重配病毒，該病毒的前體已在豬群中流行長(zhǎng)達(dá)17年之久[16]。

RT-PCR方法是當(dāng)前鑒定病毒的可靠方法，在病毒亞型鑒定、測(cè)序分析等方面具有重要作用，很多實(shí)驗(yàn)室建立的快速診斷方法能區(qū)分不同亞型的SIV，如齊海濤等[17]建立的SIV分型RT-PCR方法，能對(duì)H1、H3、N1、N2亞型進(jìn)行鑒別診斷；王博等[18]建立的SIV雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法，能對(duì)H1、H3亞型進(jìn)行鑒別診斷，但均不能特異性的實(shí)現(xiàn)對(duì)H1N1亞型古典型H1N1、類(lèi)禽型H1N1和甲型H1N1等3個(gè)譜系的快速鑒別檢測(cè)，而近年來(lái)的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，類(lèi)禽型H1N1和甲型H1N1為當(dāng)前我國(guó)豬群中流行的優(yōu)勢(shì)毒株，古典型H1N1也偶爾能監(jiān)測(cè)到[19]，因此，本試驗(yàn)建立的鑒別診斷方法對(duì)這3個(gè)譜系的鑒別診斷具有重要意義。但由于普通RT-PCR方法自身在靈敏度上的缺陷，該方法較熒光RT-PCR方法靈敏度低幾十倍，在低病毒載量樣本的檢測(cè)中可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，但該方法特異性和重復(fù)性良好，結(jié)合雞胚接種分離病毒的方法將在H1N1亞型SIV的檢測(cè)及3個(gè)譜系鑒別診斷中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立H1N1亞型古典型H1N1、類(lèi)禽型H1N1和甲型H1N1 3個(gè)主要譜系SIV的鑒別診斷RT-PCR方法，該方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為對(duì)H1N1亞型3個(gè)主要譜系SIV快速鑒別診斷的有效檢測(cè)手段，應(yīng)用前景良好。

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