豆瓣醬產(chǎn)毒黃曲霉高效拮抗菌篩選鑒定

彭漪，楊繼鴻，梁鳳英，李同靈,3，王芳，張碩，劉松青*

(1.成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源學(xué)院，成都 611130；3.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637002)

豆瓣醬作為食品調(diào)味產(chǎn)業(yè)的傳統(tǒng)主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，色、香、味俱佳，是川菜必備的調(diào)味佳品。它以蠶豆瓣、面粉和本地優(yōu)質(zhì)鮮椒為生產(chǎn)原料，采用精細(xì)、獨(dú)特的傳統(tǒng)工藝自然發(fā)酵，時(shí)間長(zhǎng)、工序多，不少環(huán)節(jié)易受黃曲霉

污染致使黃曲霉毒素超標(biāo)，不但造成豆瓣醬大量感染，產(chǎn)生的黃曲霉毒素B1更具強(qiáng)烈致癌、致畸和致突變的危害，對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織會(huì)造成破壞，嚴(yán)重的可導(dǎo)致肝癌甚至死亡[1]，對(duì)人類健康存在較大威脅。抑制黃曲霉的產(chǎn)生，降低或完全去除豆瓣中黃曲霉毒素成為豆瓣醬必須要解決的問題。

大多數(shù)豆瓣醬采用米曲霉作為動(dòng)力微生物，主要是因?yàn)槊浊箍梢援a(chǎn)生豐富的酶系。米曲霉產(chǎn)生的酶系主要包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及纖維素酶等[2]。這些酶系使得豆瓣中富含氨基酸、芳香酯和抗氧化物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分及風(fēng)味物質(zhì)[3,4]。蛋白酶是米曲霉酶系中最重要的酶之一，直接影響原料的蛋白利用率和最終產(chǎn)品的風(fēng)味[5]。氨基酸態(tài)氮(AN)是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，是評(píng)價(jià)調(diào)味食品的質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一項(xiàng)主要指標(biāo)，它能使豆瓣醬鮮味柔和，并調(diào)和香氣，增進(jìn)色澤，在發(fā)酵性食品的分析中有重要的意義[6,7]。同時(shí)米曲霉也可能影響黃曲霉的生長(zhǎng)、繁殖和產(chǎn)毒，如徐丹等發(fā)現(xiàn)米曲霉能夠有效抑制黃曲霉合成AFB1[8]。

對(duì)于發(fā)酵食品中黃曲霉菌株及黃曲霉毒素B1的抑制目前多采用一些物理的或化學(xué)的方法，不僅效果欠佳，還會(huì)造成二次污染[9-13]。目前,許多國(guó)外的研究均致力于利用微生物抑制黃曲霉，但是，國(guó)內(nèi)對(duì)黃曲霉及其毒素的研究主要集中在優(yōu)化黃曲霉毒素的檢測(cè)方法上，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，利用生物防治黃曲霉的報(bào)道極少[14]。

本研究擬從制曲的豆瓣中分離篩選黃曲霉拮抗菌并考察其對(duì)黃曲霉毒素AFB1合成的抑制作用，達(dá)到天然抗菌的目的，以期抑制豆瓣醬中黃曲霉菌生長(zhǎng)并降低其產(chǎn)毒量。同時(shí)，從制曲的豆瓣中分離篩選對(duì)黃曲霉有拮抗作用的米曲霉，研究米曲霉降解AFB1的能力，并初步比較了不同米曲霉發(fā)酵豆瓣中氨基酸態(tài)氮的含量，從而為提高豆瓣醬營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味和安全性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品材料

蒸煮拌面制曲發(fā)酵后蠶豆瓣子(簡(jiǎn)稱霉瓣子)：由四川某豆瓣廠提供。

1.1.2 主要試劑

黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫定量測(cè)試盒：無錫百奧深科技有限公司生產(chǎn)； Biomiga gDNA kit：美國(guó)Biomiga公司生產(chǎn)；引物合成：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；mqumITSL，mqumITSR，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要設(shè)備

酶標(biāo)儀(DNM-9602)：北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

分離篩選用培養(yǎng)基見表1。

表1 黃曲霉拮抗菌選擇培養(yǎng)基及其配方

1.2 拮抗菌分離及篩選

稱取霉瓣子5 g，無菌狀態(tài)下粉碎,無菌生理鹽水梯度稀釋，取不同梯度稀釋液 0.1 mL于培養(yǎng)皿中，分別澆注牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、MRS、YPD、PDA、查氏分離培養(yǎng)基， 30 ℃培養(yǎng) 48 h。待菌落長(zhǎng)出后挑取單菌落純化，將純化好的菌株于 4 ℃保藏備用。

取黃曲霉孢子懸浮液10-1，0.2 mL涂布于蠶豆天然培養(yǎng)基上，將牛津杯垂直置于培養(yǎng)基表面并輕壓，加入上述細(xì)菌菌株懸浮液10-1，0.2 mL，28 ℃培養(yǎng)3～5天，分別進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，觀察生長(zhǎng)狀況及抗菌情況。

刮取黃曲霉試管斜面上孢子，制作成50 mL的菌懸液，稀釋200 倍，從中取出1 mL均勻涂布在制好的查氏培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基上。等到菌液完全固定后，用打孔器在米曲霉邊緣打成5 mm的菌餅，每個(gè)培養(yǎng)基接1 種米曲霉，1個(gè)培養(yǎng)基做3個(gè)重復(fù)。30 ℃培養(yǎng)，觀察并記錄拮抗情況。

1.3 米曲霉對(duì)黃曲霉毒素AFB1的降解能力

將1 mL米曲霉孢子懸浮液與AFB1同時(shí)接入50 mL查氏培養(yǎng)基中，于28 ℃，150 r/min，搖床培養(yǎng)5天，檢測(cè)AFB1的含量；同時(shí)以只含AFB1的查氏培養(yǎng)基作為對(duì)照。采用固相酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)測(cè)定黃曲霉毒素含量，450 nm酶標(biāo)儀讀數(shù)， 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算AFB1含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 不同米曲霉發(fā)酵豆瓣中氨基酸態(tài)氮含量的比較

干豆瓣煮30 min，剖皮后，掰成2瓣。將米曲霉制成孢子懸浮液，分別噴灑于各份豆瓣上，攪拌混勻，28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)7天后，再用鹽水浸泡10天，每種菌株做3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵完成后采用甲醛法測(cè)定其氨基酸態(tài)氮含量。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 形態(tài)鑒定

把篩選出的菌株培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基，觀察它的菌落特征，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第 8 版)》初步鑒定。

1.5.2 分子鑒定

1.5.2.1 細(xì)菌分子鑒定

選用美國(guó)Biomiga公司Bacterial gDNA kit按照以下方法提取細(xì)菌總DNA。

基尼英語指從英格蘭東北部的紐卡斯?fàn)柕教┒骱又g的區(qū)域，人們所講的方言。這一地區(qū)的人也叫作基尼人。基尼英語也可泛指英格蘭東北部的口音和方言。

DNA提取后純化，進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增，引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。以總DNA為模板，選用27F和1492R兩段引物來擴(kuò)增16S rDNA。

PCR反應(yīng)體系均為50 μL體積，反應(yīng)體系組成如下：

2×PCR Mix 25 μL，

27F(10 μmol/L) 1.0 μL，

1492R(10 μmol/L) 1.0 μL，

DNA模板(50 ng/mL) 2.0 μL，

ddH2O 加至50 μL。

按上述組分配制反應(yīng)液分裝于200 mL PCR管中，加入DNA模板混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

1.5.2.2 米曲霉分子鑒定

采用CTAB法提取米曲霉菌總DNA，具體如下：將5種菌株分別接種于查氏培養(yǎng)基，置于30 ℃培養(yǎng)。4天后，用高壓滅菌的尖頭鑷子取一定量菌絲于滅菌EP 管內(nèi), 依次用無菌生理鹽水、20 mmol/L EDTA及無菌水漂洗, 然后用無菌的吸水紙將菌絲吸干。加20 mmol/L Tris·HCl 和20 mmol/L EDTA 各10 μL，放于-70 ℃，冰凍30 min 后，用滅菌后的研缽研磨5～10 min。重復(fù)上述冰凍研磨步驟。研磨后冰浴2～3 min，用重蒸水將研磨液稀釋。

加2% CTAB，100 mmol/L Tris·HCl (pH 8.0)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)，1.4 mol/L NaCl，65 ℃水浴45～60 min。加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻，12000 r/min 離心25 min。取上層水相再加入0.6倍體積冰冷的異丙醇，顛倒混勻，4 ℃放置20 min，10000 r/min 離心10 min，棄上清液，70%乙醇洗滌沉淀2 次。最后提取的DNA溶于30 μL TE緩沖液中。

DNA提取后純化，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物為米曲霉ITS區(qū)全長(zhǎng)序列mqumITSL和mqumITSR。

PCR反應(yīng)體系均為50 μL體積，反應(yīng)體系組成如下：

DNA模板鏈 2 μL，

2×Taq master mix 25 μL，

hqum-caIS 1 μL，

hqum-caIR 1 μL，

ddH2O 加至50 μL。

按上述組分配制反應(yīng)液，分裝于200 mL PCR管中，加入DNA模板混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)：擴(kuò)增產(chǎn)物用含有EB的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將每個(gè)PCR產(chǎn)物3 μL與溴酚藍(lán)1 μL混合點(diǎn)樣，100 V電泳30 min。UV下觀察，檢測(cè)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度和濃度。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1.5 kb左右。將擴(kuò)增產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR 產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物送擎科生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用BLAST在Gen Bank進(jìn)行比對(duì)，查找同源性高的相關(guān)基因序列，最后通過MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃曲霉拮抗菌株的篩選

2.1.1 黃曲霉拮抗菌株的篩選——細(xì)菌

從霉豆瓣中分離得到75株菌株，利用牛津杯實(shí)驗(yàn)篩選得到40株對(duì)產(chǎn)毒黃曲霉有抑制作用的菌株，其中10株抑制效果明顯，見表2。

表2 黃曲霉拮抗菌抑菌效果 cm

在牛津杯篩選實(shí)驗(yàn)中，一方面黃曲霉菌開始生長(zhǎng)，另一方面待測(cè)菌呈球面擴(kuò)散，離杯越近，待測(cè)菌濃度越大，離杯越遠(yuǎn)，待測(cè)菌濃度越小。隨著待測(cè)菌濃度減小，有一條最低抑菌濃度帶，在帶范圍內(nèi)，黃曲霉菌不能生長(zhǎng)，而呈透明的圓圈，形成“抑菌圈”，見圖1。

圖1 6株高效拮抗菌對(duì)產(chǎn)毒黃曲霉的抑制作用

注：a為7號(hào)菌，b為3號(hào)菌，c為8號(hào)菌，d為9號(hào)菌，e為1號(hào)菌，f為2號(hào)菌；黃色箭頭所指為黃曲霉，紅色箭頭所指為牛津杯，黑色箭頭所指形成的抑菌圈，影印效果無法呈現(xiàn)，詳情詢本社編輯部。

圖2 1～10號(hào)菌抑菌圈大小

抑菌圈越大，抑菌效果越好，表明此待測(cè)菌為黃曲霉有效拮抗菌。由表2可知，2-4，2-5，2-8，2-9，2-10，2-11，1-4，1-7，1-10，3-2抑菌圈較大，最大值達(dá)1.6 cm，抑菌效果明顯，是黃曲霉的高效拮抗菌，對(duì)其依次進(jìn)行重新編號(hào)：1～10號(hào)。

對(duì)1～10號(hào)菌抑菌圈大小進(jìn)行顯著性差異分析，由表3可知，顯著性差異范圍為0.79 f～1.60 a；其中7號(hào)與3號(hào)，3號(hào)與9號(hào)，9號(hào)與8，2號(hào)，8號(hào)與2，1號(hào)，2號(hào)與1，5，6，4號(hào)，1號(hào)與5，6，4，10號(hào)無顯著性差異；而7號(hào)與10號(hào)顯著性差異最大，7號(hào)為1.60 a，10號(hào)為0.79 f，相差0.81。由圖2可知，7號(hào)抑菌圈最大，3號(hào)次之，10號(hào)最小，平均抑菌圈大小在1.00 cm左右。

表3 1～10號(hào)菌抑菌圈大小顯著性差異分析(α=0.05)

2.1.2 黃曲霉拮抗菌株的篩選——米曲霉

通過培養(yǎng)皿內(nèi)對(duì)峙試驗(yàn)，從19株米曲霉中篩選到對(duì)黃曲霉有拮抗作用的菌株5 株，占到菌株總數(shù)的26%。培養(yǎng)7天后，測(cè)定各菌株的抑菌圈直徑，結(jié)果顯示抑菌圈直徑都達(dá)到10 mm以上。其中菌株1P-1，2C-3抑菌圈直徑較大，分別達(dá)到了18，16 mm，見表4和圖3。

表4 米曲霉對(duì)黃曲霉的抑制效果 mm

圖3 米曲霉對(duì)黃曲霉的抑制效果

2.2 米曲霉對(duì)黃曲霉毒素AFB1的降解能力

表5 米曲霉對(duì)黃曲霉毒素AFB1的降解能力測(cè)定

圖4 米曲霉對(duì)黃曲霉毒素AFB1的降解率測(cè)定

由表5可知，實(shí)驗(yàn)組AFB1濃度均低于對(duì)照組，說明本實(shí)驗(yàn)篩選的5株米曲霉均能降解AFB1。且由圖4可知菌株1P-2降解能力最強(qiáng)，其降解率高達(dá)69.18%，2C-3和1C-5其次，基本在60%左右。

2.3 不同米曲霉發(fā)酵豆瓣中氨基酸態(tài)氮含量的比較

將篩選得到的米曲霉及標(biāo)準(zhǔn)米曲霉(滬釀3.042米曲霉)分別發(fā)酵后，測(cè)定發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量，結(jié)果見圖5。

圖5 不同米曲霉發(fā)酵豆瓣中氨基酸態(tài)氮含量的比較

注：CK-為陰性對(duì)照，即未接種米曲霉；CK+為陽性對(duì)照，即接種標(biāo)準(zhǔn)米曲霉(滬釀3.042米曲霉)。

由圖5可知，本實(shí)驗(yàn)篩選得到的5株米曲霉中，僅菌株1C-5發(fā)酵豆瓣中氨基酸態(tài)氮含量略低于標(biāo)準(zhǔn)米曲霉(滬釀3.042米曲霉)，其余4株即菌株1P-2，2C-3，1C-1和1P-1發(fā)酵豆瓣中氨基酸態(tài)氮含量均高于標(biāo)準(zhǔn)米曲霉(滬釀3.042米曲霉)，分別高出8.919%，12.98%，4.537%，22.69%。

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)特征

篩選菌株培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天后形態(tài)特征見表6和圖6。

表6 15株拮抗菌在MRS培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)形態(tài)

圖6 1，2，4，5號(hào)菌在MRS培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)形態(tài)

注：a為1號(hào)菌，b為2號(hào)菌，c為4號(hào)菌，d為5號(hào)菌；均為箭頭所指。

2.4.2 分子鑒定

2.4.2.1 細(xì)菌分子鑒定

最終選取的10株菌測(cè)序后通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其中4株菌株(編號(hào)分別為1，3，5，6)與葡萄球菌屬菌株的16S rRNA的相似性達(dá) 100%；3株菌株(編號(hào)分別為2，7，8，9)與庫特氏菌屬菌株的16S rRNA的相似性達(dá) 100%；4，10號(hào)與克雷伯菌的16S rRNA的相似性達(dá) 100%，見表7。

表7 10株菌與參比菌株的相似性

基于16S rRNA基因序列構(gòu)建了上述10株菌株及其參比菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7。該系統(tǒng)發(fā)育樹表明，菌株8，9與Kurthiasp.B4的遺傳距離最近；菌株2與Kurthiagibsoniistrain VIT-AKS的遺傳距離最近；菌株4，10與Klebsiellapneumoniaestrain C-X5C的進(jìn)化距離最近；菌株3與Staphylococcussaprophyticusstrain PJS/1遺傳距離最近；菌株5，6與Staphylococcusgallinarumstrain 2141的進(jìn)化距離最近；即它們的親緣關(guān)系最高。

圖7 基于16S rRNA基因序列10株高效拮抗菌系統(tǒng)發(fā)育樹圖

2.4.2.2 米曲霉分子鑒定

5株對(duì)產(chǎn)毒黃曲霉活性有較高抑制效果的米曲霉菌株測(cè)序后通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與米曲霉菌F6的18S rRNA的相似性達(dá) 99%。

基于18S r RNA 基因序列構(gòu)建了上述5株菌株及其參比菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖8。

圖8 基于18S rRNA基因序列5株高效拮抗菌系統(tǒng)發(fā)育樹圖

該系統(tǒng)發(fā)育樹表明5株菌株與米曲霉菌株F6的遺傳距離最近，即它們的親緣關(guān)系最高。

3 討論

當(dāng)前在細(xì)菌對(duì)黃曲霉的拮抗作用的研發(fā)中發(fā)現(xiàn)的拮抗菌主要包括乳酸菌屬、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等[15-21]，而本文通過微生物間拮抗作用，首次發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬、庫特氏菌屬、克雷伯菌也能抑制黃曲霉且抑制效果顯著。它們是黃曲霉的高效拮抗菌，在糧食生產(chǎn)和儲(chǔ)藏中具有很好的應(yīng)用潛力。在牛津杯實(shí)驗(yàn)中，10株菌株在平板上形成透明圈，可能原因是這些拮抗菌產(chǎn)生了某些代謝產(chǎn)物抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)，具體抑制機(jī)理下一步將做探究。

本研究篩選的葡萄球菌屬、庫特氏菌屬、克雷伯菌能高效抑制產(chǎn)毒黃曲霉的生長(zhǎng)，且這3類菌未曾被發(fā)現(xiàn)作為黃曲霉拮抗菌，為以后進(jìn)一步探究這些拮抗菌抑制產(chǎn)毒黃曲霉生長(zhǎng)的機(jī)制和食品工業(yè)的安全生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

氨基酸態(tài)氮(AN)能使豆瓣醬鮮味柔和，并調(diào)和香氣，增進(jìn)色澤，氨基酸態(tài)氮從而成為評(píng)價(jià)豆瓣醬質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，氨基酸態(tài)氮含量越高，豆瓣品質(zhì)越好。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的5株米曲霉中，4株米曲霉發(fā)酵豆瓣中氨基酸態(tài)氮含量均高于標(biāo)準(zhǔn)米曲霉(滬釀3.042米曲霉)，其中菌株1P-1和1C-1的發(fā)酵效果較優(yōu)秀，分別高出22.69%和12.98%，因此將菌株1P-1 和1C-1用于工業(yè)生產(chǎn)可大大提高豆瓣醬的氨基酸態(tài)氮含量，從而增進(jìn)豆瓣醬的風(fēng)味和品質(zhì)。

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