龍眼提取物對(duì)H2O2致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

李紅艷 倪雪嬌 陳曉霞 賈思禹 宋 婷

1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用國(guó)家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110032

龍眼俗名桂圓，其假種皮龍眼肉具有補(bǔ)益心脾、養(yǎng)血安神[1]等功效，并有改善記憶[2]、抗氧化[3]等作用。目前龍眼中僅龍眼肉作為藥用部位，對(duì)龍眼殼、核等并無有效的開發(fā)利用。據(jù)報(bào)道，龍眼殼、核具有抗氧化、抗腫瘤[4-7]等作用，實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為其大量廢棄不僅給炮制加工帶來不便，同時(shí)造成了資源的浪費(fèi)與環(huán)境的污染。本研究擬通過探討龍眼不同提取物的神經(jīng)保護(hù)作用，為龍眼的炮制加工及擴(kuò)大應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 龍眼購自大連金鴻潤(rùn)食品發(fā)展有限公司，經(jīng)王添敏副教授鑒定為無患子科植物龍眼(DimocarpuslonganLour.)的干燥成熟果實(shí)；PC12細(xì)胞(高分化)，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)；胰蛋白酶、雙抗、Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒均購自Genview；NU-4750型二氧化碳培養(yǎng)箱(Nuaire)。

1.2 方法

1.2.1 龍眼不同部位的制備 干燥龍眼，分離肉、殼、核，分別稱重、粉碎，各取100.00 g，按1∶12(m∶v)加入去離子水微沸提取1 h，提取3次，合并濾液，60℃減壓濃縮成浸膏，即得龍眼肉、龍眼殼、龍眼核提取物，以下簡(jiǎn)稱龍眼肉、殼、核。

1.2.2 龍眼肉不同極性提取物的制備 精密稱取龍眼肉100.00 g，同上煎煮，向?yàn)V液中加入乙酸乙酯反復(fù)萃取至上層液體無色，收集合并上層溶液，得乙酸乙酯提取物；下層加入正丁醇反復(fù)萃取至上層無色，收集上、下層溶液，分別得正丁醇提取物和水提取物。60 ℃減壓濃縮成浸膏。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，以105/mL接種于96孔板， 待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為正常組、模型組和給藥組，每組3個(gè)復(fù)孔。除正常組外，各組細(xì)胞用200 μM H2O2處理12 h，給藥組于造模12 h后加入不同濃度的受試藥物(最小濃度分別是各提取物的最低有效濃度)。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，采用MTT法于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞，鋪于6 cm培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分為正常組、模型組和龍眼肉組(乙酸乙酯提取物1.6 mg/mL)。除正常組外，其余各組加入200 μM H2O2孵育12h，龍眼肉組于造模前加藥預(yù)處理2 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，每組3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍眼不同部位對(duì)細(xì)胞增殖的影響 顯微鏡觀察可見，正常組細(xì)胞貼壁良好，軸突明顯；模型組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，突起腫脹破裂，有脫壁漂浮現(xiàn)象；給藥組細(xì)胞形態(tài)趨于正常，突起損傷減輕，結(jié)構(gòu)較完整。各組代表性圖片如圖1A所示。MTT檢測(cè)結(jié)果表明，細(xì)胞存活率模型組較正常組下降；龍眼肉、殼、核組較模型組升高(P<0.05，P<0.01，圖2B-D)，三者平均細(xì)胞存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但濃度相差懸殊(圖2E)。綜合評(píng)價(jià)，筆者認(rèn)為龍眼肉提取物的神經(jīng)保護(hù)作用最強(qiáng)。

2.2 龍眼肉不同極性提取物對(duì)細(xì)胞增殖的影響 不同極性提取物均有神經(jīng)保護(hù)作用(圖2A-C)；相同濃度下，乙酸乙酯提取物促進(jìn)增殖最明顯(圖2D)。如圖2所示。

2.3 龍眼肉乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 模型組較正常組活細(xì)胞數(shù)減少，凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05，P<0.01，圖3D-G)；龍眼肉組即龍眼肉乙酸乙酯提取物較模型組活細(xì)胞數(shù)增加，中晚期凋亡及壞死細(xì)胞減少(P<0.05，圖3D、F、G)，早期凋亡細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但有降低趨勢(shì)(圖3E)。如圖3所示，

3 討論

本論研究用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，并采用龍眼提取物進(jìn)行預(yù)處理或治療，結(jié)果表明，龍眼肉、殼、核提取物，均能提高受損細(xì)胞存活率，且以龍眼肉用量最小，龍眼殼促進(jìn)增殖作用最顯著。綜合考慮三者的量效差異，認(rèn)為龍眼肉作用效果最好；同時(shí)，龍眼中殼、核所占比重不小，二者有很強(qiáng)的作用，如果一并入藥，可減少炮制加工，并擴(kuò)大了龍眼的藥用來源。另外，根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果推測(cè)，抑制中晚期細(xì)胞凋亡與壞死是龍眼神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制，值得進(jìn)一步深入研究。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015.

[2]白亞娟, 劉磊, 張瑞芬, 等. 龍眼果肉提取物改善東莨菪堿誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(21): 4203-4213.

[3]林耀盛, 張名位, 張瑞芬, 等. 不同品種龍眼果肉酚類物質(zhì)的抗氧化活性比較[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 34(3): 20-30.

[4]宋佳玉, 張清偉, 劉金寶, 等. 龍眼殼粗黃酮提取物體內(nèi)外抗腫瘤研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2016, 37(3): 40-43.

[5]劉煥云, 王海燕, 梁燕. 龍眼殼黃酮的微波提取及體外抗氧化活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2015, 27(3): 434-441.

[6]郭倩倩, 張曉衛(wèi), 周暄宣, 等. 龍眼的化學(xué)成分與藥理活性研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011, 11(23): 4552-4555.

[7]周凱, 胡卓炎, 周沫霖, 等. 龍眼核提取物的體外抗氧化及抑菌活性研究[J]. 食品與機(jī)械, 2015 (4): 167-171.

[8]胡爽, 滕利榮, 張峻榕, 等. 一種新型化合物的合成及對(duì) PC12 高分化細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2015, 36(11): 2322-2328.