一測多評法測定金銀花中咖啡?？崴犷惢瘜W(xué)成分的含量

徐玉平，蔣向輝，王 翔

(凱里學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州凱里 556011)

金銀花別稱忍冬(Lonicerajaponica)，是忍冬科忍冬屬藥用植物[1]。金銀花作為一種常用中藥，已有上千年的使用歷史。長期以來，綠原酸與木犀草苷的含量被作為評價金銀花質(zhì)量的標(biāo)志性成分，而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，金銀花中富含有機酸、黃酮、揮發(fā)油等多種生物活性成分[2]，因此，找到更多的能全面反映金銀花質(zhì)量的活性成分很有必要。金銀花的花蕾與葉片中富含咖啡酰奎尼酸，咖啡酰奎尼酸是奎尼酸與咖啡酸形成的酯，由于咖啡酸的數(shù)目與位置不同，咖啡酰奎尼酸包括綠原酸、果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等6種不同單體[3]。咖啡?？崴嵊星鍩?、解毒等功效[4-5]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、食品和化妝品行業(yè)中[6-7]。

近年來，已有采用外標(biāo)法同時測定金銀花中綠原酸、果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等成分含量的相關(guān)報道[3，8]，由于異綠原酸A、B、C對照品的價格昂貴且不容易獲得，導(dǎo)致外標(biāo)法難以在實際工作中廣泛應(yīng)用，限制了金銀花多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式的實現(xiàn)。隨著通過測定一種成分來實現(xiàn)對多個成分含量檢測的一測多評法(quantitative analysis of multi-components by single-marker，簡稱QAMS)在藥材或復(fù)方制劑含量測定中的應(yīng)用[9-11]，一測多評法的優(yōu)勢突顯。本課題組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實綠原酸與異綠原酸A、B、C間存在相互轉(zhuǎn)化，為更合理地評價金銀花藥材的品質(zhì)，以綠原酸為對照品，采用一測多評法，同時測定金銀花中果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C等成分的含量，為金銀花藥材的質(zhì)量控制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

主要儀器有Waters2695高效液相色譜儀、極管陣列檢測器(photo-diode array，簡稱PDA)、EmpowerTM色譜工作站軟件，均購自美國Waters公司；Hypersil ODS-2色譜柱(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)(美國Thermo公司)、Hypersil ODS-2色譜柱(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)(大連依利特分析儀器有限公司)、Fisher ODS-2色譜柱(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)(北京賽維特姆科技有限公司)與Spherisorb ODS-2色譜柱(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)(美國Waters公司)等4種色譜柱；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司)；Milli-Q超純水機(德國Merck公司)。

1.2 試驗試劑

主要試劑有甲醇、冰醋酸，均為色譜純，其他試劑為優(yōu)級純；綠原酸、果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C標(biāo)準(zhǔn)品均購自湖南省食品藥品檢驗研究院。定量測定的金銀花樣品分別采自山東省臨沂市平邑縣、湖南省邵陽市隆回縣與河南省新鄉(xiāng)市封丘縣，經(jīng)懷化學(xué)院劉光華教授鑒定為忍冬屬植物金銀花初期開的花。

2 結(jié)果與分析

2.1 一測多評方法的考察

2.1.1 色譜條件 采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，簡稱HPLC)[12]測定混合對照品溶液及供試品溶液樣品中各成分的含量(圖1)，色譜檢測條件：反相C18柱(5 μm，250.0 mm × 4.6 mm)，流動相為甲醇-0.5 %冰醋酸(體積比為30 ∶70)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL，柱溫為30 ℃。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別稱取10 mg綠原酸、果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品，用甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為195.20、205.40、194.30、192.30、207.60、188.30 μg/mL的混合對照品溶液，避光保存，放于4℃冰箱中備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取金銀花藥材，在60℃條件下烘干至恒質(zhì)量，粉碎以后過20目篩。精確稱取5 g金銀花粉末，放入250 mL具塞錐形瓶中，按料液比1 g ∶15 mL加入70%的乙醇溶液浸泡1 h，在55 ℃超聲(60 kHz)提取1 h，加70%的乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，抽濾。再減壓抽濾3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇至干，殘渣加適量95%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，繼續(xù)加95%甲醇至刻度，攪拌均勻，用 0.45 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確吸取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL混合對照品溶液至10 mL量瓶中，分別加95%甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾后，分別取 20 μL 濾液注入液相色譜儀，按“2.1.1”節(jié)色譜條件測定各成分含量。以濃度(C)的對數(shù)值對峰面積(A)的對數(shù)值進行線性回歸處理，得到綠原酸、果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的回歸方程。結(jié)果表明，6種咖啡?？崴岢煞衷谙鄳?yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表1)。

表1 6種咖啡酰奎尼酸類成分的線性關(guān)系和范圍

2.1.5 相對校正因子(fsi)的計算 參照郭盛等的方法[13]，以綠原酸為內(nèi)參物，計算fsi=fs/fi=(lgAs×lgCi)/(lgCs×lgAi)。As為內(nèi)參物綠原酸峰面積(mAu)；Cs為綠原酸質(zhì)量濃度(%)；Ai為某待測成分i的峰面積(mAu)；Ci為待測成分i的質(zhì)量濃度(%)；fs為lgAs與lgCi的乘積；fi為lgAi與lgCi的乘積。結(jié)合“2.1.4”節(jié)系列質(zhì)量濃度對照品溶液所得峰面積數(shù)據(jù)，分別計算綠原酸對果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的fsi，結(jié)果如表2所示。

2.1.6 精密度試驗 精確吸取混合對照品溶液20 μL，按“2.1.1”節(jié)色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰的峰面積。結(jié)果表明，綠原酸、果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，簡稱RSD)分別為1.56%、2.06%、2.34%、1.78%、2.13%、1.96%，均小于2.50%，表明儀器精密度較好。

表2 5種咖啡酰奎尼酸的相對校正因子

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 分別取產(chǎn)自山東省臨沂市平邑縣、湖南省邵陽市隆回縣與河南省新鄉(xiāng)市封丘縣的金銀花供試品溶液各3份，分別于制備后0、2、4、8、16、20、24 h進樣測定咖啡?？崴犷惓煞趾浚Y(jié)果表明綠原酸、果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C峰面積的RSD值分別為1.87%，2.32%、1.99%、2.23%、1.76%、1.86%，均小于2.50%。說明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗 精確稱取3個產(chǎn)地的金銀花供試樣品各3份，按“2.1.3”節(jié)的方法制備供試品溶液，并測定質(zhì)量分數(shù)，綠原酸、果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C質(zhì)量分數(shù)的RSD值分別為2.42%、1.88%、2.38%、1.97%、2.45%、2.39%，均小于2.5%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 精確稱取已測定質(zhì)量分數(shù)的約2.5 g金銀花花蕾粉末，平行6份，分別加入相當(dāng)于藥材中各指標(biāo)成分量的對照品溶液，依“2.1.3”節(jié)方法制備供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果表明，綠原酸、果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C的加樣回收率分別為99.36%、98.75%、102.9%、98.89%、99.76%、103.39%，RSD值分別為1.76%、2.48%、2.55%、2.06%、1.95%、2.82%。

2.2 一測多評法耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性評價

2.2.1 校正因子的重現(xiàn)性考察 按照朱粉霞等的方法[14]取系列混合對照溶液，混合對照品溶液為1號，稀釋倍數(shù)為2、10、20、40倍的分別為2號、3號、4號和5號，在HPLC考察Hypersil ODS-2色譜柱(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)、Hypersil ODS-2色譜柱(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)、Fisher ODS-2色譜柱(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)與Spherisorb ODS-2色譜柱(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)4種色譜柱后所得的相對校正因子及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表3所示，結(jié)果表明，不同色譜柱所測得各成分的相對校正因子無顯著差異，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%。

表3 不同色譜柱對fsi的影響

注：同列數(shù)據(jù)后相同小寫字母表示在0.05水平上差異不顯著。

2.2.2 待測組分色譜峰的定位 通過計算在不同色譜柱中各待測成分色譜峰與綠原酸色譜峰的相對保留時間(rsi)，對各待測成分進行定位，結(jié)果(表4)表明，不同儀器和色譜柱測得的rsi相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，表明利用rsi進行峰的定位是可行的。

表4 不同色譜柱對rsi的影響

2.2.3 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較 取采自不同產(chǎn)地的金銀花花蕾與幼葉粉末，按“2.1.3”節(jié)方法制備供試品溶液，精確吸取20 μL溶液注入液相色譜儀，按“2.1.2”節(jié)色譜條件測定各成分含量。分別采用外標(biāo)法和一測多評法計算金銀花花蕾與幼葉中綠原酸、果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C的含量。由表5可知，對QAMS與外標(biāo)法所測得的各指標(biāo)成分含量進行t檢驗所得的P值均大于0.05，表明2種測定方法得到的含量之間無顯著差異，說明QAMS用于金銀花花蕾與幼葉中多種咖啡?？崴犷惓煞仲|(zhì)量評價是可行的。

3 討論

咖啡?？崴犷惢瘜W(xué)成分作為金銀花的生物活性成分，有很好的抑菌、消炎與抗病毒的作用[15]，為金銀花藥材的主要活性成分。由于綠原酸在咖啡?？崴犷惓煞趾肯鄬^高，2015年版《中國藥典》規(guī)定綠原酸為金銀花藥材的主要考察指標(biāo)，而由于異綠原酸和隱綠原酸在金銀花中含量相對較低[14]，并且異綠原酸類同分異構(gòu)體結(jié)構(gòu)相似，獲得單一的異綠原酸通常比較困難，導(dǎo)致在考察金銀花藥材質(zhì)量時異綠原酸類成分的含量通常被忽視。大量研究表明，異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C具有較強的抗病毒、抗氧化、抗真菌和抗人類免疫性缺陷病毒的作用[15]。因此，同時檢測多種咖啡?？崴犷惢瘜W(xué)成分的含量是合理和有效地考察金銀花藥材質(zhì)量的方法。Guo等采用高速逆流色譜技術(shù)與制備高效液相色譜技術(shù)成功地建立了異綠原酸A與異綠原酸C的分離技術(shù)體系[16]，為一測多評法在金銀花藥材質(zhì)量控制中的應(yīng)用打下了較好的基礎(chǔ)。

表5 QAMS與外標(biāo)法測定金銀花咖啡?？崴犷惓煞趾勘容^

本研究測定的6種成分中，以綠原酸相對含量較高，且在各樣品中含量差異較小，綠原酸對照品易得，故以其作為內(nèi)參物建立金銀花藥材的QAMS法，該方法所得到的6種咖啡?？崴岷康挠嬎阒蹬c傳統(tǒng)外標(biāo)法所得實測值之間進行t檢驗，所得的P值均大于0.05，顯示2種測定方法得到的含量之間無顯著差異，表明QAMS法可以在缺失對照品的情況下，以綠原酸為對照對金銀花藥材中多種咖啡酰奎尼酸類成分進行分析評價。本研究在建立的相對校正因子評價中，考察4種不同品牌、型號的色譜柱對各指標(biāo)成分之間相對校正因子重現(xiàn)性的影響，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，結(jié)果表明不同色譜柱所測得各成分的相對校正因子之間差異未達到顯著水平，說明一測多評法可以同時測定金銀花藥材綠原酸、果酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C含量。

一測多評法是使用單一的標(biāo)準(zhǔn)品去同時檢測多種成分的含量，其中目標(biāo)分析物的相對轉(zhuǎn)換因子是根據(jù)其紫外吸收與標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收的相對比率來確定的，這種方法適用于有相似紫外吸收特性的多種化合物的分析。在植物藥中同時進行多種有效成分含量的檢測將是藥材質(zhì)量控制發(fā)展的趨勢。在金銀花類藥材分析中同時檢測黃酮、皂苷、環(huán)烯醚萜苷等多類成分的含量是當(dāng)前研究的重點[17]。但是，由于缺乏穩(wěn)定可靠的標(biāo)準(zhǔn)對照品，限制了一測多評法的廣泛應(yīng)用與推廣，這有待藥用植物有效成分提取分離與純化鑒定技術(shù)的進一步發(fā)展。

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