利用果脯廢糖液發(fā)酵制備蘋(píng)果酒及其抗氧化性分析

許先猛，董文賓，盧 軍，景建國(guó)

(1.運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院有機(jī)食品工程系，山西運(yùn)城 044000；2.陜西省漢中市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西漢中 723000；3.山西澤源食品有限公司，山西運(yùn)城 044000)

中國(guó)是世界上最大的蘋(píng)果生產(chǎn)地，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的40%以上[1]。蘋(píng)果中含有豐富的膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)、蘋(píng)果酸、糖、蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)[2]，因此，蘋(píng)果及其深加工產(chǎn)品廣受消費(fèi)者歡迎。近年來(lái)，蘋(píng)果酒越來(lái)越受到人們的關(guān)注。蘋(píng)果酒營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種酚類物質(zhì)和有機(jī)酸[3-4]，蘋(píng)果酒對(duì)人體健康有很多積極作用[5]，能夠調(diào)整人體的新陳代謝，具有很強(qiáng)的抗氧化性，同時(shí)還具有促進(jìn)血液循環(huán)、軟化血管、降低血脂等功效[6-7]，經(jīng)常飲用有利于人體健康。隨著人們生活水平的提高，蘋(píng)果酒保健功效也越來(lái)越被人們認(rèn)可，蘋(píng)果酒產(chǎn)業(yè)也將有廣闊的發(fā)展前景。

山西運(yùn)城是我國(guó)蘋(píng)果種植大市，蘋(píng)果種植面積 14.82萬(wàn)hm2，產(chǎn)量380萬(wàn)t，種植面積占全國(guó)的8.3%，產(chǎn)量占全國(guó)的10%[8]，當(dāng)?shù)靥O(píng)果深加工產(chǎn)業(yè)也較為發(fā)達(dá)，蘋(píng)果果脯深受廣大消費(fèi)者歡迎。運(yùn)城蘋(píng)果果脯生產(chǎn)企業(yè)十余家，年產(chǎn)生蘋(píng)果果脯廢糖液 8萬(wàn)t 左右。由于存在轉(zhuǎn)化糖含量較高、顏色太深、pH值偏低和回收處理工序較為復(fù)雜等問(wèn)題，企業(yè)對(duì)廢糖液采取直接廢棄處理，造成巨大的資源浪費(fèi)和一定的環(huán)境污染。蘋(píng)果果脯廢糖液富含多種維生素、礦物質(zhì)、蘋(píng)果多酚、水溶性膳食纖維和蘋(píng)果芳香酯類物質(zhì)，筆者以企業(yè)產(chǎn)生的蘋(píng)果果脯廢糖液和濃縮蘋(píng)果汁為原料，采用響應(yīng)面法對(duì)蘋(píng)果酒生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期提高蘋(píng)果果脯加工過(guò)程中的原輔料利用率，減少環(huán)境污染，提高果脯蜜餞類企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料 濃縮蘋(píng)果汁(可溶性固形物含量68.6%)，陜西海升果業(yè)有限公司運(yùn)城分公司；蘋(píng)果果脯廢糖液，山西澤源食品有限公司。

1.1.2 試劑 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究院；食品級(jí)豬皮明膠，山東淄博寶恩生物科技有限公司；殼聚糖、檸檬酸鈉、檸檬酸、焦亞硫酸鈉、福林酚、氫氧化鈉、酚酞、碳酸鈉、1，1-二苯基-2-苦苯肼(DPPH)、無(wú)水乙醇、鄰二氮菲、鄰苯三酚以及其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；GNP-9160隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TD-45數(shù)顯糖度計(jì)，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技有限公司；CPA124S型電子天平，德國(guó)SARTORIUS公司；微量移液器，芬蘭Dragonmed公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；HH-Z2恒溫水浴鍋，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘋(píng)果果脯廢糖液檢測(cè)指標(biāo) 蘋(píng)果果脯廢糖液含糖量較高，高濃度糖液能夠抑制微生物生長(zhǎng)，但酵母菌和霉菌耐糖性較強(qiáng)，若貯存不當(dāng)，仍會(huì)引起腐敗變質(zhì)，廢糖液測(cè)定結(jié)果顯示，蘋(píng)果果脯廢糖液感官特性呈現(xiàn)為黑褐色濃稠狀，有蘋(píng)果香味，有酸澀味，過(guò)甜；廢糖液可溶性固形物含量為74.2%；廢糖液總糖含量為62.5%；廢糖液黏度(25 ℃、200 mL廢糖液流下時(shí)間)為285 s；廢糖液中SO2含量為82 mg/L；廢糖液中菌落總數(shù)為300 CFU/mL?？梢?jiàn)蘋(píng)果果脯廢糖液可以作為輔料發(fā)酵制備蘋(píng)果酒。

1.2.2 蘋(píng)果酒生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)[9-12]蘋(píng)果酒生產(chǎn)工藝流程如下：

1.2.2.1 調(diào)糖度 果酒生產(chǎn)過(guò)程中一般通過(guò)補(bǔ)加白砂糖或蜂蜜調(diào)整發(fā)酵糖度，本研究通過(guò)添加蘋(píng)果果脯廢糖液調(diào)節(jié)糖度。以1.7 g糖經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)1%乙醇計(jì)算[6]，在充分考慮發(fā)酵轉(zhuǎn)化率的基礎(chǔ)上，初始糖度控制在20～30°Brix。

1.2.2.2 調(diào)節(jié)SO2在果酒生產(chǎn)過(guò)程中添加偏重亞硫酸鈉可以有效抑制雜菌的生長(zhǎng)和繁殖，起到護(hù)色作用[13-14]，提高果酒品質(zhì)穩(wěn)定性。蘋(píng)果果脯加工過(guò)程中一般會(huì)使用偏重亞硫酸鈉進(jìn)行護(hù)色，因此，廢糖液中也有偏重亞硫酸鈉殘留。通過(guò)添加偏重亞硫酸鈉調(diào)整果汁中SO2含量為40～80 mg/L。

1.2.2.3 調(diào)節(jié)pH值 酵母發(fā)酵的最適pH值為4.0左右[6，15-16]，調(diào)整pH值為3.5～4.5。

1.2.2.4 接種 接種筆者篩選的D7高產(chǎn)乙醇酵母菌，采用10%乙醇選擇性富集方法，從蘋(píng)果皮和蘋(píng)果果脯廢糖液中富集和分離的185株菌經(jīng)過(guò)三級(jí)篩選選出D7高產(chǎn)乙醇酵母菌[17]，接種量為3%～5%。

1.2.2.5 發(fā)酵 控制發(fā)酵溫度為20～30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為8～12 d，終止發(fā)酵。

1.2.2.6 澄清 為了保證酒體的穩(wěn)定性，采用澄清劑的方法對(duì)酒體進(jìn)行澄清。取5 g食品級(jí)豬皮明膠，溶于100 mL 50 ℃ 蒸餾水中，制成5%明膠溶液；取1 g殼聚糖，溶于 100 mL 0.1%檸檬酸溶液中，加熱煮沸至完全溶解，制成1%殼聚糖溶液。分別添加0.5%明膠溶液和0.1%殼聚糖溶液，混合均勻，靜置48 h，倒罐除去沉淀。

1.2.2.7 通氣 蘋(píng)果酒發(fā)酵過(guò)程中會(huì)有大量二氧化碳放出，伴隨溫度升高、糖度下降、乙醇度和酸度升高等現(xiàn)象，短時(shí)間的通氣或放氣有利于酵母繁殖增長(zhǎng)和二氧化碳的放出，保證發(fā)酵順利進(jìn)行[18]。為了防止雜菌污染，應(yīng)減少蘋(píng)果酒與空氣接觸時(shí)間，通氣頻率控制為1～3 d通氣1次。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定方法 乙醇度測(cè)定采用乙醇蒸餾的方法[19]；糖度通過(guò)手持糖度儀測(cè)定；酸度采用酸堿滴定的方法測(cè)定，以酚酞作為指示劑，用NaOH溶液進(jìn)行滴定，根據(jù)消耗的NaOH溶液量計(jì)算總酸含量。

1.2.4 多酚含量測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定多酚含量[20]，吸取1 mL備測(cè)蘋(píng)果酒溶液，用蒸餾水稀釋至10 mL。取1 mL稀釋液，加到10 mL容量瓶中，加入5.0 mL 10%福林酚試劑，搖勻后反應(yīng)6 min。加入4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容，搖勻，常溫靜置1 h，待測(cè)。

1.2.5 蘋(píng)果酒發(fā)酵因素篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì) 研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果酒發(fā)酵過(guò)程中的影響因素包括發(fā)酵液初始pH值、糖度、有效SO2含量、菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、通氣頻率[3-4，10-13]。應(yīng)用Design-Expert軟件對(duì)蘋(píng)果酒發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)，并對(duì)發(fā)酵的7個(gè)因素進(jìn)行篩選，外加4個(gè)虛擬變量。每個(gè)變量分別確定(+)和(-)2個(gè)水平，進(jìn)行12次試驗(yàn)以確定其影響因子，線性模型方程式[21]為

Y=β0+∑βixi，(i=1，2，…，k)。

(1)

試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素水平

1.2.6 蘋(píng)果酒發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 應(yīng)用Design-Expert軟件，采用中心組合設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)方法，對(duì)PB法篩選出的3個(gè)重要因素(糖度、接種量、發(fā)酵溫度)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)固定其他非關(guān)鍵因素[6，15，17，22]：pH值4.0，有效SO2添加量80 mg/L，發(fā)酵時(shí)間12 d，通氣頻率1次/d。中心組合設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表2。

表2 中心組合設(shè)計(jì)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

通過(guò)蘋(píng)果酒發(fā)酵后乙醇度回歸性分析，得到各影響因子的偏回歸系數(shù)及顯著性，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

從表4可以看出，因素X1、X2、X4、X5、X6、X7、X8對(duì)蘋(píng)果酒多乙醇度的影響為正效應(yīng)，即增大正效應(yīng)因素的值，蘋(píng)果酒乙醇度呈增加趨勢(shì)；因素X3、X9、X10、X11對(duì)蘋(píng)果酒乙醇度的影響為負(fù)效應(yīng)，即隨著負(fù)效應(yīng)因素的減小，蘋(píng)果酒乙醇度呈降低趨勢(shì)。因素X2(糖度)、X4(接種量)、X5(發(fā)酵溫度)為主要影響因素，其貢獻(xiàn)值分別為 50.86%、17.60%、14.25%，而4個(gè)虛擬因素對(duì)蘋(píng)果酒乙醇度影響值分別為0.044%、0.70%、0.18%、0.40%，表明得到的線性回歸方程是可用的。以蘋(píng)果酒乙醇度為響應(yīng)值得到的線性回歸方程為

乙醇度=8.62+0.57X2+0.33X4+0.30X5。

(2)

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表4 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

注：E表示的是影響水平，當(dāng)E為正時(shí)，該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果為正影響；當(dāng)E為負(fù)時(shí)，該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果為負(fù)影響。

從表5可以看出，方差分析模型的P值為 0.002 0，表明所得回歸性方程達(dá)到極顯著，即該模型在整個(gè)研究區(qū)域擬合得很好。R2=0.827 1，表明相關(guān)性很好；精密度為10.273，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。

表5 蘋(píng)果酒乙醇度回歸模型方程的方差分析

2.2 CCD優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果與響應(yīng)面分析

通過(guò)對(duì)糖度、接種量和發(fā)酵溫度進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)(CCD)(表6)，得到相應(yīng)的二次方程模型：

Y=9.86+0.81A+0.51B-0.37C+0.15AB-0.013AC-0.082BC-0.52A2-0.95B2-0.17C2。

(3)

式中：Y為響應(yīng)值，即蘋(píng)果酒乙醇度；A、B、C分別為蘋(píng)果酒發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液初始糖度、接種量、發(fā)酵溫度。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合的二次模型方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表7。F值為6.33，R2=0.890 5，回歸方程達(dá)到顯著水平(P<0.05)，且失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際試驗(yàn)值擬合較好，可以利用該回歸方程對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表6 中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果

表7 中心組合設(shè)計(jì)二次模型方差分析

從表8可以看出，二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明，因素A(糖度)對(duì)蘋(píng)果酒發(fā)酵乙醇度影響極顯著，因素B(接種量)、因素C(發(fā)酵溫度)對(duì)蘋(píng)果酒發(fā)酵乙醇度影響顯著；AB、AC、BC對(duì)乙醇度的交互影響不顯著；因素A2、B2對(duì)乙醇度的曲面效應(yīng)顯著，因素C2對(duì)乙醇度的曲面效應(yīng)不顯著。利用Design-Expert 8.0軟件在設(shè)定的因素水平內(nèi)對(duì)回歸方程進(jìn)行數(shù)學(xué)規(guī)劃，得到乙醇度最高的優(yōu)化組為糖度 27.70°Brix，接種量5.78%，發(fā)酵溫度26.81 ℃。在此條件下，蘋(píng)果酒發(fā)酵乙醇度預(yù)測(cè)值為10.524°。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在蘋(píng)果酒最佳發(fā)酵條件下，即發(fā)酵液初始pH值為4.0、糖度為28°Brix、有效SO2含量為80 mg/L、菌種接種量為6.0%、發(fā)酵溫度為27 ℃、發(fā)酵時(shí)間為12 d、通氣頻率為 1次/d，進(jìn)行蘋(píng)果酒發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)測(cè)蘋(píng)果酒發(fā)酵結(jié)束后乙醇度為10.3°，與預(yù)測(cè)值10.524°較接近，預(yù)測(cè)精度達(dá)97.87%，證明了PB和CCD方法連用優(yōu)化蘋(píng)果果酒發(fā)酵條件具備一定的可行性和準(zhǔn)確性。

表8 二次模型回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

2.4 蘋(píng)果酒抗氧化性研究

3 討論與結(jié)論

蘋(píng)果果脯廢糖液含糖量較高，可溶性固形物含量在70%以上，同時(shí)富含多種天然維生素、礦物質(zhì)、多酚類物質(zhì)、水溶性膳食纖維和蘋(píng)果芳香酯類物質(zhì)等成分，是發(fā)酵制備蘋(píng)果酒的理想原料。以蘋(píng)果果脯廢糖液作為蘋(píng)果酒生產(chǎn)的主要原料，能降低蘋(píng)果酒生產(chǎn)成本，增加蘋(píng)果果脯生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)避免廢糖液對(duì)環(huán)境造成污染。

蘋(píng)果果脯廢糖液顏色較深，紀(jì)陽(yáng)等采用活性炭+大孔樹(shù)脂混合恒溫浸漬方式聯(lián)合脫色劑對(duì)無(wú)花果果脯蜜餞褐變糖液脫色[28]，高振鵬等采用活性炭吸附法對(duì)獼猴桃果脯廢糖液進(jìn)行脫色，處理效果較為理想[29]。作為蘋(píng)果酒發(fā)酵原料，本研究未進(jìn)行脫色處理，生產(chǎn)出的蘋(píng)果酒呈現(xiàn)黃色色澤，產(chǎn)品感官品質(zhì)良好。

通過(guò)PB設(shè)計(jì)，對(duì)蘋(píng)果酒發(fā)酵的7個(gè)因素進(jìn)行篩選，包括發(fā)酵液初始pH值、糖度、有效SO2含量、菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、通氣頻率，并確定發(fā)酵糖度、菌種接種量、發(fā)酵溫度3個(gè)因素為主要影響因素，且這3個(gè)因素對(duì)蘋(píng)果酒乙醇度影響能力依次降低。衛(wèi)春會(huì)等經(jīng)過(guò)工藝優(yōu)化，證明蘋(píng)果酒發(fā)酵影響因素排序?yàn)榘l(fā)酵糖度>接種量>發(fā)酵時(shí)間[6]，范兆軍研究表明，蘋(píng)果酒發(fā)酵影響因素排序?yàn)槠鹗继嵌?發(fā)酵溫度>接種量>SO2添加量[22]，上述結(jié)論與本研究結(jié)果基本相同。通過(guò)CCD優(yōu)化設(shè)計(jì)，優(yōu)化得到蘋(píng)果酒發(fā)酵條件為發(fā)酵液初始pH值4.0、糖度28°Brix、有效SO2含量80 mg/L、菌種接種量6.0%、發(fā)酵溫度27 ℃、發(fā)酵時(shí)間12 d、通氣頻率 1次/d，發(fā)酵蘋(píng)果酒乙醇度為 10.3°，確定蘋(píng)果酒二次方程模型為Y=9.86+0.81A+0.51B-0.37C+0.15AB-0.013AC-0.082BC-0.52A2-0.95B2-0.17C2。

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