質(zhì)譜法研究氣相中18—冠醚—6與氨基酸的非共價(jià)相互作用

吳若菲

摘 要 利用電噴霧電離質(zhì)譜研究了在氣相條件下18冠醚6與20余種天然氨基酸及其異構(gòu)體間的非共價(jià)相互作用。定性結(jié)果表明，在氣相中18冠6可以與氨基酸形成化學(xué)計(jì)量比為1∶1的非共價(jià)復(fù)合物。配制一系列不同濃度的18冠6分別與固定濃度的氨基酸反應(yīng)，利用質(zhì)譜測(cè)得反應(yīng)物和產(chǎn)物的質(zhì)譜峰， 計(jì)算冠醚分別與L苯丙氨酸、L酪氨酸、L賴氨酸和L天冬氨酸反應(yīng)的復(fù)合物結(jié)合常數(shù)lgKa分別為3.90、 3.75、 4.06和3.64， 基于此建立了校準(zhǔn)曲線。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，以上述4種氨基酸與冠醚復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)為參考值，可推算得到其余氨基酸與冠醚的結(jié)合常數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冠醚氨基酸復(fù)合物的穩(wěn)定性與氨基酸的種類相關(guān)，節(jié)堿性氨基酸以及側(cè)鏈?zhǔn)峭榛ɑ驓湓樱┑陌被釋?duì)冠醚的親和性更好， 而酸性氨基酸（如L絲氨酸）以及側(cè)鏈上有酰胺鍵的氨基酸，對(duì)冠醚的親和性較低。 研究了18冠6對(duì)L型氨基酸及其D型異構(gòu)體的手性選擇性，結(jié)果表明，18冠6只能識(shí)別部分中性氨基酸。

關(guān)鍵詞 18冠醚6； 氨基酸； 電噴霧電離質(zhì)譜； 非共價(jià)相互作用

1 引 言

1967年，杜邦公司的Pedersen[1，2]在實(shí)驗(yàn)室首次合成了一種新的大環(huán)聚醚化合物，這類化合物主要由-CH2CH2O-的重復(fù)單元組成，由于其形狀酷似皇冠，所以被統(tǒng)稱為冠醚。典型的冠醚及其衍生物如圖1所示，冠醚的命名原則通常采用Pedersen法[1]。例如1，4，7，10，13，16六氧環(huán)十八烷C12H24O6（圖1a），可稱為18冠醚6（簡(jiǎn)寫成18冠6或18c6）。

冠醚外層親脂而內(nèi)層親水，其空腔可由不同的合成方法被調(diào)控，因此，它能夠選擇性地與金屬陽(yáng)離子或其它小分子絡(luò)合[3，4]。此外，冠醚衍生物還可以手性識(shí)別和分離某些對(duì)映體化合物[5，6]。如今，冠醚的應(yīng)用涉及生物化學(xué)、能源等多個(gè)領(lǐng)域，包括離子選擇性電極、離子活化與抑制、色譜手性固定相、大環(huán)液晶、相轉(zhuǎn)移催化劑、膜轉(zhuǎn)運(yùn)離子載體等[7～10]。

近年來(lái)，由于冠醚與蛋白質(zhì)或多肽等生物大分子中的某些氨基酸殘基如賴氨酸殘基的特異性結(jié)合非共價(jià)相互作用日益受到人們的關(guān)注，這種結(jié)合使得冠醚可以作為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)探針，即冠醚具有潛在的分子識(shí)別作用[11]。 在進(jìn)行以非共價(jià)方式加合蛋白質(zhì)的探針實(shí)驗(yàn)[12～13]時(shí)，冠醚類化合物可與蛋白質(zhì)上的賴氨酸殘基的側(cè)鏈相結(jié)合。Stedwell等[14]通過(guò)紅外多光子解離技術(shù)研究了冠醚與質(zhì)子化氨基酸形成的復(fù)合物，紅外光譜圖顯示NH+3中NH伸縮振動(dòng)的紅移比較明顯，表明NH+3與冠醚間的相互作用相當(dāng)穩(wěn)定。Chen等[15]通過(guò)導(dǎo)向離子束串聯(lián)質(zhì)譜（GIBMS）及理論計(jì)算，對(duì)18冠6與5種氨基酸分別形成的復(fù)合物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)冠醚與氨基酸的結(jié)合常數(shù)隨其質(zhì)子親和性增強(qiáng)而減小。研究冠醚與各種氨基酸間結(jié)合作用的強(qiáng)弱，對(duì)于冠醚在多肽藥物的篩選，以及冠醚在靶向藥物方面的應(yīng)用都具有積極意義。但目前尚未見(jiàn)對(duì)冠醚和常見(jiàn)氨基酸的非共價(jià)作用進(jìn)行系統(tǒng)性定性和定量分析的文獻(xiàn)報(bào)道。

近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)迅速發(fā)展， 電噴霧質(zhì)譜已經(jīng)成為研究非共價(jià)復(fù)合物一種強(qiáng)有力的工具 [16，17]。本研究在以18冠6為代表，采用電噴霧電離質(zhì)譜法（ESIMS）研究冠醚對(duì)20種L型天然氨基酸的非共價(jià)作用，用質(zhì)譜滴定法定量測(cè)定18冠6分別與20種L或D型氨基酸的結(jié)合常數(shù)，探討不同氨基酸的氨基端、羧基端和側(cè)鏈對(duì)復(fù)合物結(jié)合強(qiáng)度的影響，同時(shí)用簡(jiǎn)易的方法探索了18冠6對(duì)氨基酸對(duì)映體的手性選擇性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

電噴霧電離質(zhì)譜（ESIMS）儀器為API3000型質(zhì)譜儀（SCIEX公司），質(zhì)量精度由聚丙二醇（PPG）校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)氣體均為99.99%的高純氮?dú)狻?/p>

18冠6（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甘氨酸（Glycine，Gly）、L賴氨酸（Lysine，Lys）、L精氨酸（Arginine，Arg）、L組氨酸（Histidine，His）、L丙氨酸（Alanine，Ala）、L苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）、L色氨酸（Tryptophan，Trp）、L纈氨酸（Valine，Val）、L亮氨酸（Leucine，Leu）、L異亮氨酸（Isoleucine，Ile）、L脯氨酸（Proline，Pro）、L蛋氨酸（Methionine，Met）、L酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、L絲氨酸（Serine，Ser）、L蘇氨酸（Threonine，Thr）、L半胱氨酸（Cysteine，Cys）、L天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）、L天冬酰胺（Asparagine，Asn）、L谷氨酸（Glutamic acid，Glu）和L谷氨酰胺（Glutamine，Gln）及它們的D型異構(gòu)體（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度≥98%）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

ESI正離子模式，電噴霧電壓為4.5 kV，進(jìn)樣速率為3 μL/min。實(shí)驗(yàn)中，所有溶劑均為甲醇水體系（1∶1，V/V，含有0.1%甲酸），pH=3.6。

3.3 結(jié)合常數(shù)的計(jì)算

將不同濃度的18冠6與LPhe混合，使得混合后18冠6的濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mmol/L，氨基酸的濃度為0.10 mmol/L。由一級(jí)質(zhì)譜圖和式（1）、（2）、（3）可以得到表1。

采用同樣方法可以得到冠醚分別與LTyr、LLys和LAsp及與其D型異構(gòu)體間的結(jié)合常數(shù)（表2）。結(jié)合圖4可知，定性分析結(jié)果與定量計(jì)算結(jié)果相符。以LAsp、LLys、LPhe和LTyr為第一客體，分別繪制校準(zhǔn)曲線（表3）。

LPro與冠醚的結(jié)合常數(shù)（lgKa=3.17）較低，可能的原因在于N端的剛性結(jié)構(gòu)使其不易與冠醚結(jié)合。酸性氨基酸中，LGlu與冠醚的結(jié)合常數(shù)（lgKa=4.01）大于LAsp（lgKa=3.64），因?yàn)長(zhǎng)Glu側(cè)鏈上的羰基離N端氨基較遠(yuǎn)，吸電子效應(yīng)更低。在中性氨基酸中，LSer和LThr對(duì)冠醚的親和力也較低，推測(cè)是N端氨基上的氮原子與側(cè)鏈的羥基上的氧原子間形成了分子內(nèi)氫鍵[19]、導(dǎo)致質(zhì)子化的氨基難以進(jìn)攻冠醚；LAsn或LGln與冠醚的結(jié)合常數(shù)是20種氨基酸中最低的，可能因?yàn)樗鼈兊膫?cè)鏈上具有吸電子的酰胺。endprint

此外，測(cè)量和計(jì)算方法也會(huì)對(duì)氨基酸跟冠醚的結(jié)合常數(shù)的大小產(chǎn)生影響。Chen等[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在堿性氨基酸中，LLys對(duì)18冠6的親和性最強(qiáng)，故LLys殘基的側(cè)鏈?zhǔn)枪诿雅c蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)結(jié)合時(shí)的有效位點(diǎn)；Gly對(duì)冠醚的親和性最強(qiáng)，即比起氨基酸側(cè)鏈上的氨基，其N端上的氨基更易與冠醚配位。Chen等[15]認(rèn)為這是因?yàn)?8冠6具有三重對(duì)稱軸（D3d），且空腔尺寸合適，所以形成了3個(gè)NH+ O的氫鍵，而冠醚能使質(zhì)子化的NH+3穩(wěn)定存在，即冠醚對(duì)NH+3有很好的親和力。Yu等[20]通過(guò)熒光滴定法測(cè)得的18冠6與Trp的結(jié)合常數(shù)（lgKa=2.19）低于本研究測(cè)得值（lgKa=4.04）。這是因?yàn)镋SIMS會(huì)加強(qiáng)靜電作用，削弱疏水作用，因此通過(guò)ESIMS測(cè)得的結(jié)合常數(shù)大于通過(guò)熒光法測(cè)得值。

總之，因氨基酸側(cè)鏈上的基團(tuán)不同，氨基酸對(duì)18冠6的親和性也不同。通常，當(dāng)氨基酸具有多個(gè)NH2基團(tuán)或不含側(cè)鏈時(shí)，它對(duì)冠醚的親和性會(huì)更高。因此，推測(cè)NH3+與冠醚的配位方式如圖6所示。

4 結(jié) 論

本研究利用ESIMS研究了18冠醚6和20種天然氨基酸之間的非共價(jià)相互作用。結(jié)果表明，18冠醚6與氨基酸能形成化學(xué)計(jì)量比為1∶1的非共價(jià)復(fù)合物。冠醚主要通過(guò)與氨基酸上的NH2配位而與其結(jié)合，故在L型氨基酸中，側(cè)鏈為烷基（或氫原子）的氨基酸、堿性氨基酸對(duì)冠醚的親和性更強(qiáng)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)也表明冠醚僅能識(shí)別部分中性氨基酸及其異構(gòu)體。

擬在本研究基礎(chǔ)上， 繼續(xù)研究冠醚與特定的多肽的結(jié)合情況，觀察是否符合冠醚與氨基酸的結(jié)合規(guī)律，也可以探索空腔尺寸不同的冠醚或冠醚衍生物與氨基酸極其衍生物的結(jié)合情況，以期為冠醚類化合物在生物制藥篩選等領(lǐng)域的發(fā)展提供參考。

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Abstract The noncovalent interactions between 18crown6 （18c6） and 20 common types of protonated amino acids were explored by electrospray ionization mass spectrometry （ESIMS）. The mass spectra showed the formation of 1∶1 stoichiometric noncovalent complexes between 18c6 and amino acids. The calibration curves and linear equations for the complexes of LPhe， LTyr， LLys and LAsp with 18c6 were established by mass spectrometric titration and used as reference values for competitive ESIMS. Through competitive equilibrium， the binding constants for the complexes of 18c6 with other Lamino acids and their Disomers were derived. It was found， as a general trend， lgKa for the complexes of 18c6 with the basic amino acid and the amino acid with alkyl side chain were larger than other complexes， and among the amino acids with alkyl side chain， Gly and Ala exhibited greater 18c6 binding affinities. As for Ser and Thr， the intramolecular hydrogen bond between the nitrogen atom from terminal NH2 and the oxygen atom from carboxyl may impede their protonated aminogroup to attack the 18c6. Furthermore， Gln and Asn exhibited lower 18c6 binding affinities probably due to effects of electronwithdrawing group of acylamide. Finally， the chiral selectivity of 18c6 for 19 L， or Damino acids was measured by ESIMS， indicating 18c6 could only recognize some neutral amino acid isomers.

Keywords 18Crown6； Amino acid； Electrospray ionization mass spectrometry； Noncovalent binding affinity

（Received 5 May 2017； accepted 20 September 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 2011YQ14015006）.endprint