川楝子黃酮的提取和初步純化

謝肖鋒

（貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

川楝子（Fructus Toosendan）是落葉喬木川楝樹(shù)（Melia toosendan Sib.et Zucc.）的干燥成熟果實(shí)，在冬季采收[1]。川楝子作為驅(qū)蟲(chóng)藥已有悠久的歷史，同時(shí)也作為傳統(tǒng)的理氣藥，主產(chǎn)于川、黔、湘、鄂等地，其中川產(chǎn)為上乘，而作為道地藥材，因此被稱(chēng)作川楝子[2]?！侗静菥V目》有記載，此藥味道酸而苦，具有毒性，是寒性藥；入肝、胃、小腸經(jīng)。現(xiàn)代藥理研究實(shí)驗(yàn)證明，川楝子具有驅(qū)蛔殺蟲(chóng)、抗菌、抗肉毒、消炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤[3]、抗氧化、抑制破骨細(xì)胞[4]等作用。川楝子中主要活性成分有川楝素等萜類(lèi)化合物和黃酮類(lèi)化合物[5]。

黃酮化合物的提取方法主要有超聲提取法、微波提取法、超臨界流體提取法、酶提取法、水浸出法和有機(jī)溶劑提取法等[6]。雖然超聲提取、超臨界提取和酶提取等方法提取效果好提取效率高，但考慮設(shè)備比較昂貴，提取條件要求高和經(jīng)濟(jì)投入大且難以進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)提取。因此，目前工業(yè)化普遍采用水提或有機(jī)溶劑提取法[7-8]。本文采用含水乙醇回流法設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行川楝子黃酮的提取，采用樹(shù)脂吸附法進(jìn)行川楝子黃酮的初步純化，為川楝子資源的進(jìn)一步研究和利用提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材

川楝子，購(gòu)于貴州省藥材公司。

1.2 主要試劑

亞硝酸鈉（AR，南臺(tái)華鑫化學(xué)試劑有限公司）；硝酸鋁（AR，廣東汕頭市西隴化工廠）；氫氧化鈉（AR，重慶川江化學(xué)試劑廠）；95%乙醇（AR，重慶川江化學(xué)試劑廠）；AB-8樹(shù)脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；D101樹(shù)脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；NKA-9樹(shù)脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；聚酰胺樹(shù)脂（30目-60目）（青島海洋化工生物有限責(zé)任有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（1198-081209購(gòu)于國(guó)家工程研究中心，純度≥98%）。

1.3 主要儀器

FA2004分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；DS-205A超聲波發(fā)生器（寧波市海曙達(dá)盛超聲波儀器廠）；HH-S電熱恒溫水浴鍋（江蘇金壇市億通電子有限公司）；UV-1801分光光度計(jì)（北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；DGG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；SHB-B95A型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；WFZ-2000分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；JA1203精密電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原材料預(yù)處理

將購(gòu)買(mǎi)的川楝子藥材放入烘箱60℃烘48 h，粉碎，過(guò)60目篩，備用。將新購(gòu)買(mǎi)的D-101、聚酰胺樹(shù)脂浸泡在95%的乙醇中24 h，使樹(shù)脂充分溶脹，然后用95%乙醇沖洗，直到流出液加水不出現(xiàn)白色渾濁為止，再用蒸餾水沖洗至無(wú)醇味。用5%鹽酸溶液沖洗浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性，再用5%NaOH溶液沖洗并浸泡4 h，最后用蒸餾水洗至中性，備用[9]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品（60℃下干燥至恒重）21.80 mg置于100mL容量瓶中，加入一定量乙醇在超聲下使其完全溶解，乙醇定容至刻度，搖勻即得對(duì)照品溶液。

2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在400～600 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定對(duì)照品溶液的吸光值。測(cè)定結(jié)果顯示在509 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇509 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

吸取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL和7.0mL，分別置于7個(gè)25mL容量瓶中，均加入乙醇至8mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻后靜置6 min，加入1.0mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min，加10.0mL 4%氫氧化鈉溶液，加蒸餾水至刻度，搖勻后靜置15 min，以乙醇代替對(duì)照品溶液作為空白對(duì)照，在509 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程和R2。

2.4 提取方法

稱(chēng)取一定量川楝子粉末置于圓底燒瓶中，加入一定量適宜濃度的乙醇，加熱微沸回流提取一定時(shí)間，抽濾，減壓濃縮，真空干燥備用。

分別對(duì)上述提取方法中的液料比、乙醇濃度、提取時(shí)間三個(gè)影響因素進(jìn)行單因素考察和正交試驗(yàn)優(yōu)化。

2.5 川楝子黃酮的含量測(cè)定

精密量取供試品溶液3.0mL置于25mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻后靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻后靜置6 min，加入10.0mL 4%氫氧化鈉溶液，加蒸餾水至刻度，搖勻后靜置15 min，以70%乙醇代替供試液作為空白對(duì)照，在509 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算川楝子中黃酮的含量。

2.6 D101大孔樹(shù)脂純化工藝考察

2.6.1 動(dòng)態(tài)上樣量的考察

樹(shù)脂的泄漏曲線與富集效率密切相關(guān)，根據(jù)上述靜態(tài)吸附率和解吸率，選擇較好的一種樹(shù)脂。取一定量預(yù)處理樹(shù)脂，柱床體積（BV）為30mL，濕法裝入1.6 cm×30 cm層析柱，將川楝子粗提物水溶液（質(zhì)量體積比為79.6 mg/mL）以2mL/min的流速動(dòng)態(tài)吸附，以10mL每份收集流出液，測(cè)定吸光值，計(jì)算流出液總黃酮濃度，繪制樹(shù)脂的泄漏曲線。

2.6.2 提取液不同pH對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附的影響

取5根1.6 cm×30 cm的層析柱，分別裝入預(yù)處理好的D101樹(shù)脂30mL，上樣液90mL（質(zhì)量體積比為79.6 mg/mL），pH分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，以2mL/min的流速進(jìn)行上柱，根據(jù)上樣液濃度和流出液濃度計(jì)算吸附率，確定最適樣液的pH值。

2.6.3 上樣流速對(duì)樹(shù)脂吸附的影響

取4根1.6 cm×30 cm的層析柱，分別裝入預(yù)處理好的D101吸附樹(shù)脂30mL，上樣液90mL（質(zhì)量體積比為79.6 mg/mL），分別以1、2、3、4mL/min的流速進(jìn)行上柱，根據(jù)上樣液濃度和流出液濃度計(jì)算吸附率，選出最佳上樣流速。

2.6.4 不同濃度乙醇洗脫對(duì)解吸率的影響

取5根1.6 cm×30 cm的層析柱，分別裝入預(yù)處理好的D101吸附樹(shù)脂30mL，上樣量均為90mL（質(zhì)量體積比為79.6 mg/mL），先以5BV蒸餾水洗脫，然后再分別用40%，50%，60%，70%和80%乙醇各50mL按2mL/min速度洗脫，洗脫液測(cè)黃酮含量，確定最佳醇洗濃度。

2.6.5 洗脫液流速對(duì)解吸率的影響

取4根1.6 cm×30 cm的層析柱，分別裝入吸附飽和的D101樹(shù)脂30mL，先用5 BV蒸餾水洗脫，然后用60%的乙醇5BV洗脫，分別控制流速為1、2、3、4mL/min收集洗脫液，計(jì)算洗脫率，選出最佳洗脫液流速。

2.6.6 洗脫劑用量考察

取1.6 cm×30 cm的層析柱，裝入吸附飽和的D101樹(shù)脂30mL，先以5BV蒸餾水洗脫，然后以60%乙醇，2mL/min的流速進(jìn)行洗脫，每10mL收集1次洗脫液，測(cè)定吸光值，計(jì)算總黃酮濃度，確定洗脫體積和終點(diǎn)。

2.7 類(lèi)似方法考察聚酰胺樹(shù)脂純化工藝

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照2.3的方法，繪制得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，在8.72～61.04 mg/L的濃度范圍內(nèi)，吸光度值與總黃酮濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.015 1x-0.038 7，R2=0.998 5。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 提取單因素考察結(jié)果

乙醇濃度對(duì)提取率的影響如圖2，結(jié)果選擇70%乙醇濃度。

圖2 乙醇濃度的考察

液料比對(duì)提取率的影響如圖3，結(jié)果選擇30∶1的液料比。

圖3 液料比的考察

提取時(shí)間對(duì)提取率的影響如圖4，結(jié)果選擇回流提取時(shí)間為3 h。

圖4 提取時(shí)間的考察

3.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用L9（34）正交表格，選擇液料比（A）、乙醇濃度（B）、回流時(shí)間（C）為考察因素，選擇適當(dāng)?shù)囊蛩厮椒秶源ㄩ狱S酮提取率為指標(biāo)對(duì)川楝子總黃酮提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2和表3。由表2可以看出，各因素對(duì)川楝子黃酮提取的影響主次為：液料比＞乙醇濃度＞提取時(shí)間。液料比和乙醇濃度具有顯著性影響。最佳提取條件為A2B2C3，即液料比35∶1，乙醇濃度70%，提取時(shí)間3.5 h。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

3.4 大孔樹(shù)脂D101工藝參數(shù)

樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量的測(cè)定如圖5，選擇60mL為合適的上樣量。

圖5 上樣量的考察

上樣液pH對(duì)吸附率的影響如圖6，選擇上樣液pH值為6。

圖6 上樣液pH的考察

上樣流速對(duì)樹(shù)脂吸附的影響如圖7，最佳上樣流速選擇2mL/min。

圖7 上樣流速的考察

不同濃度乙醇洗脫對(duì)解吸率的影響如圖8，采用60%乙醇為洗脫劑。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析表

表3 正交試驗(yàn)方差分析

圖8 洗脫劑濃度的考察

洗脫液流速對(duì)解吸率的影響如圖9，選擇2mL/min為最佳洗脫流速。

圖9 洗脫流速的考察

3.4.6洗脫終點(diǎn)的確定，如圖10，確定90mL為洗脫劑用量。

圖10 洗脫終點(diǎn)的考察

聚酰胺樹(shù)脂工藝考察結(jié)果，上樣質(zhì)量體積比為78.8 mg/mL，上樣流速為2mL/min，上樣量為90mL（BV=30mL），吸附4 h后，用70%乙醇洗脫，洗脫流速為2mL/min。

4 結(jié)論

通過(guò)提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，得到提取最佳工藝條件為：液料比35∶1，乙醇濃度70%，回流時(shí)間3.5 h，重復(fù)回流3次，在此工藝下，提取物黃酮含量為3.71%，得率為0.585%。

通過(guò)純化工藝的初步考察實(shí)驗(yàn)，得到初步純化工藝為：提取物黃酮含量可從原來(lái)的3.71%提高到20.3%。

5 討論

通過(guò)對(duì)川楝子黃酮的提取實(shí)驗(yàn)得到的一些經(jīng)驗(yàn)：藥材回流提取完成后冷卻到一定程度趁熱過(guò)濾，否則會(huì)形成果凍狀；減壓蒸餾時(shí)候要注意避免溶液爆沸。這可能與藥材中含有多糖皂苷等雜質(zhì)有關(guān)。乙醇回流提取重復(fù)性好，污染小，成本低，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，同時(shí)采用紫外分光光度法測(cè)定黃酮含量簡(jiǎn)便快速。采用大孔樹(shù)脂法進(jìn)行初步純化，對(duì)黃酮含量流失較少，工藝參數(shù)可控。本實(shí)驗(yàn)可為川楝子黃酮的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供參考。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2]孫建.川楝子化學(xué)成分及炮制質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[D].濟(jì)南:山東中醫(yī)藥大學(xué),2009.

[3]劉小玲.川楝素提取物的制備和抗腫瘤機(jī)理研究[D].重慶:重慶醫(yī)科大學(xué),2009.

[4]周英,郭東貴,王慧娟,等.川楝子抑制破骨細(xì)胞活性組份的研究[J].中藥材,2009,32(9):1433-1435.

[5]郭慧,熊邦虎,趙行,等.川楝子活性成分石油醚提取與GC-MS分析[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào),2007,33(5):1113-1117.

[6]曾云想,郁建平.藤茶總黃酮提取方法的優(yōu)選[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2013,32(2):153-158.

[7]宋先亮,張嘉.川楝子黃酮類(lèi)化合物成分分析[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2011,31(1):101-104.

[8]賀亮,宋先亮,殷寧,等.川楝子總黃酮和多糖提取及其抗氧化活性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2007,5(5):78-82.

[9]張強(qiáng)祖.中藥材黃酮的大孔樹(shù)脂吸附工藝研究及生產(chǎn)線設(shè)計(jì)[D].上海:華東理工大學(xué),2013.