木薯秸稈發(fā)酵產(chǎn)糖預(yù)處理工藝的研究

沈娟，唐楚穎，董夢(mèng)依

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（南京），江蘇南京 210095）（2.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西南昌 330031）

當(dāng)前，人們對(duì)化石能源過分依賴，其過度消耗的同時(shí)還帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染，這促使各國(guó)不得不將目光投向各種新能源的開發(fā)，其中生物質(zhì)能源這一領(lǐng)域越來(lái)越受到人們的關(guān)注。生物質(zhì)能源經(jīng)轉(zhuǎn)化可成為清潔的二次能源，主要包括固體燃料、液體燃料和氣體燃料。燃料乙醇是指添加到汽油，柴油作為燃料的乙醇，其可以代替部分石油，緩解石油資源的短缺，是第二代生物燃料的主體，其按照一定比例和汽油混合，可得到一種緩和的燃料-乙醇汽油，其對(duì)環(huán)境污染較小且是可再生的資源，同時(shí)農(nóng)林生產(chǎn)中大量生物質(zhì)（包括木質(zhì)纖維素）的遺棄，使得燃料乙醇的開發(fā)應(yīng)用具有巨大潛力。

作為制備燃料乙醇最主要原料之一的木薯，在華東一帶農(nóng)村山區(qū)被廣泛種植[1]。而木薯采收后的主要廢棄部分-木薯秸稈，通常用于動(dòng)物飼料或回田，甚至直接焚燒，這些處理方法不僅浪費(fèi)能源，還會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染。因此，尋找有效處理木薯稈的方法成為木薯工業(yè)中一個(gè)亟待解決的問題。而采用微生物降解木質(zhì)纖維素產(chǎn)糖以及相應(yīng)的木質(zhì)纖維素的預(yù)處理是目前研究最為廣泛的課題之一[2～4]。

傳統(tǒng)預(yù)處理方法包括物理預(yù)處理法、物理化學(xué)預(yù)處理法、化學(xué)預(yù)處理法和生物預(yù)處理法[5]。但是傳統(tǒng)的預(yù)處理方法不利于脫除木質(zhì)素，物理化學(xué)爆破法成本高，生物預(yù)處理法周期長(zhǎng)，處理效率較低，化學(xué)預(yù)處理法環(huán)境污染大[4,6]。本文參考其它文獻(xiàn)，提出用聯(lián)合預(yù)處理的方法處理木薯秸稈，將常規(guī)堿預(yù)處理、微波/堿預(yù)處理、超聲波/堿預(yù)處理三種方法進(jìn)行比較研究，并在此基礎(chǔ)上對(duì)不同預(yù)處理后的木薯秸稈進(jìn)行了糖化比較，以獲得有利于糖化的最佳預(yù)處理?xiàng)l件。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯秸稈，原料取自江西東鄉(xiāng)，沖洗干凈于105 ℃，24 h烘干至恒重后磨粉并過40目篩備用。測(cè)得木薯稈有關(guān)化學(xué)組分的含量分別為：纖維素28.8±0.2%，半纖維素19.2±0.4%，木質(zhì)素10.2±0.7%以及灰分0.50±0.1%。

綠色木霉（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，菌種編號(hào)CICC 40202）。

實(shí)驗(yàn)中所用其它試劑均為分析純。

1.2 常規(guī)堿預(yù)處理工藝

取一定量的木薯秸稈于不同濃度的NaOH溶液中（固液比1:8 m/m），充分混勻并煮沸一定的時(shí)間(20～70 min)，殘?jiān)盟粗林行裕?05 ℃干燥至恒重并稱重。

1.3 微波/堿預(yù)處理工藝

本實(shí)驗(yàn)用微波爐（KD23B-DA，廣東美的微波爐制造有限公司）控制微波條件，并將微波爐的功率設(shè)為800 W。具體實(shí)驗(yàn)過程為取一定量的木薯秸稈于不同濃度的NaOH溶液中（固液比1:10 m/m），充分混勻并微波處理一定的時(shí)間(20～70 min)，殘?jiān)盟粗林行裕?05 ℃干燥至恒重并稱重。

1.4 超聲波/堿預(yù)處理工藝

本實(shí)驗(yàn)用超聲儀（KQ-300VED，中國(guó)昆山超聲波儀制造有限公司）控制超聲波條件，并將超聲儀的功率設(shè)為100 W。具體實(shí)驗(yàn)過程為取一定量的木薯稈于不同濃度的NaOH溶液中（固液比1:10 m/m），充分混勻并超聲波處理一定的時(shí)間(20～70 min)，同時(shí)加熱至80 ℃，殘?jiān)盟粗林行裕?05 ℃干燥至恒重并稱重。

1.5 微生物發(fā)酵經(jīng)預(yù)處理的木薯秸稈產(chǎn)糖

1.5.1 發(fā)酵培養(yǎng)基

木薯秸稈7.5 g，（NH4）2SO42.8 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，KH2PO42.0 g，尿素0.3 g，吐溫80 2.0 g，微量元素液1 mL，水1000 mL，pH 4.5。

微量元素液：FeSO4·H2O 5.0 g，MnSO4·H2O 1.6 g，ZnCl21.4 g，水1000 mL。

1.5.2 發(fā)酵條件

在接種量11 mL孢子懸浮液（菌體濃度5×105CFU/mL），裝液量100 mL，初始pH 4.6，發(fā)酵溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每12 h取一次樣，每個(gè)樣品均先用45 μm的濾膜進(jìn)行過濾以除去菌體，再于3000 r/min的條件下離心30 min，取上層清液進(jìn)行還原糖分析。當(dāng)還原糖的產(chǎn)量最高時(shí)，取殘留物沖洗至中性，烘干至恒重并進(jìn)行化學(xué)組分含量的測(cè)定。

1.6 分析方法

纖維素、半纖維素及灰分含量的測(cè)定采用范式(Van Soest)改良法[7]，木質(zhì)素含量的測(cè)定采用72%H2SO4的方法[8]。還原糖含量的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)[9]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所以實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)報(bào)道的表示形式為：平均值±方差。本文中木薯秸稈及其水解殘留物的化學(xué)組分均為干重。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿濃度及操作條件對(duì)預(yù)處理木薯稈的重量損失的影響

由圖1可以看出，1%、2%和3% NaOH溶液分別常規(guī)堿處理木薯稈60 min后，木薯稈的重量損失值穩(wěn)定在52.2%、56.3%和57.7%幾乎保持不變。由圖2可以看出，經(jīng)1%、2%、3% NaOH溶液微波/堿處理木薯稈40 min后，再延長(zhǎng)處理時(shí)間，木薯稈的重量損失沒有再增加，而是保持在59.3%、61.1%和61.3%。由圖3可以看出，在1%、2%和3% NaOH溶液超聲波/堿處理木薯稈40 min后，木薯稈的重量損失值分別穩(wěn)定在44.9%、48.6%和52.3%。由此可得，第一，經(jīng)微波/堿處理方法得到的木薯稈的重量損失明顯高于常規(guī)堿處理和超聲波/堿處理，這是由于微波輻射提高了木薯稈與處理過程的溫度，并且增強(qiáng)了預(yù)處理過程中的某些化學(xué)反應(yīng)。第二，在三種堿預(yù)處理過程中，堿濃度對(duì)重量損失有著較大的影響，并且隨著堿濃度的增加，重量損失也在不斷增加，但增加的程度在不斷地減少。因?yàn)槟臼矶捲陬A(yù)處理過程中的重量損失是由于木薯稈中的某些化學(xué)組分（如木質(zhì)素）在NaOH溶液中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而溶于其中所致，所以堿濃度的增加有助于該化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行，但當(dāng)堿濃度增加的一定程度時(shí)，這方面的影響就較小。例如，2%、3% NaOH溶液微波/堿處理木薯稈40 min后的重量損失為61.1%和61.3%，僅增加了0.20%，幾乎沒有變化，但是堿濃度卻增加了50%，并對(duì)后續(xù)的處理也增加了相當(dāng)高的成本，因此，在此時(shí)，2% NaOH溶液進(jìn)行預(yù)處理要優(yōu)于3% NaOH溶液。

圖1 不同濃度堿溶液常規(guī)堿處理木薯稈重量損失的過程曲線Fig.1 Process curve of weight loss of cassava straw with different concentrations of alkali solution by conventional alkali treatment

圖2 不同濃度堿溶液微波/堿處理木薯稈重量損失的過程曲線Fig.2 Process curves of weight loss of cassava straw with different concentrations of alkali solution by microwave/alkali treatment

圖3 不同濃度堿溶液超聲波/堿處理木薯稈重量損失的過程曲線Fig.3 Process curves of weight loss of cassava straw with different concentrations of alkali solution by ultrasonic/alkali treatment ions of alkaline solution

2.2 堿濃度及操作條件對(duì)預(yù)處理木薯稈的化學(xué)組分的影響

由表1可以看出，第一，當(dāng)處理方法和處理時(shí)間相同時(shí)，隨著堿濃度的增加，或者是處理方法和堿濃度相同時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，纖維素和灰分的含量在不斷增加，而木質(zhì)素的含量是在不斷降低的，但是增加以及減少的程度在不斷地降低。木質(zhì)素含量的降低是由于其在堿溶液中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而不斷溶于堿中。纖維素和灰分含量的增加則是由于其他組分不斷溶于堿溶液所致；

第二，在處理時(shí)間相同時(shí)，隨著堿濃度的增加，或者是堿濃度相同時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，在常規(guī)堿處理及微波/堿處理?xiàng)l件下，半纖維素的含量在不斷增加，而在超聲波/堿處理?xiàng)l件下，半纖維素的含量在不斷減少，這可能是由于超聲波改變了纖維素與半纖維素之間的結(jié)構(gòu)，是半纖維素的含量隨著堿處理時(shí)間和堿濃度的增加而不斷溶于堿液中[10]；第三，將三種處理方法得到的木薯稈的成分對(duì)比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)微波/堿處理方法得到的木薯稈的纖維素含量最高，半纖維素含量最低。這是由于微波輻射增加了半纖維素在堿液中的溶解度，而使半纖維素含量降低，纖維素含量相對(duì)增加。將圖1～3和表1進(jìn)行聯(lián)合比較可以發(fā)現(xiàn)，在相同的處理方法下，隨著堿濃度和處理時(shí)間的增加，纖維素含量和重量損失均在不斷增加，但這種增加的程度卻在減少，因此，考慮到成本及環(huán)境影響的因素，選擇2% NaOH溶液常規(guī)堿處理60 min，2% NaOH溶液微波/堿處理40 min，2% NaOH溶液超聲波/堿處理40 min為改處理方法下的最佳處理?xiàng)l件，并取經(jīng)這三種方法處理得到的木薯稈進(jìn)行后續(xù)糖化水解實(shí)驗(yàn)。

表1 堿濃度及操作條件對(duì)預(yù)處理木薯稈的化學(xué)組分的影響Table 1 Effects of concentrations of alkali solution and operating conditions on chemical components of pretreatment cassava straw

2.3 微生物發(fā)酵經(jīng)預(yù)處理的木薯秸稈產(chǎn)糖

圖4 綠色木霉發(fā)酵產(chǎn)糖過程曲線Fig.4 Process curves of saccharification fermented by Trichoderma viride

由圖4可得，第一，在84 h左右，三種不同底物的發(fā)酵液的還原糖產(chǎn)量達(dá)到最高，此后隨培養(yǎng)時(shí)間的增加產(chǎn)糖沒有明顯升高，其原因可能為菌體利用還原糖生長(zhǎng)，并產(chǎn)生反饋抑制減少酶的釋放，使還原糖產(chǎn)量降低。第二，底物c的還原糖產(chǎn)量最高，達(dá)到0.522 mg還原糖/g木薯稈，這是由于微波輻射增加了半纖維素在堿液中的溶解度，是半纖維素含量最少，而纖維素含量相對(duì)達(dá)到最高，而綠色木霉只能產(chǎn)生降解纖維素的酶系，不能降解半纖維素[11]。第三，從表1可得，底物b的纖維素含量低于底物a，但是在圖4中底物b的還原糖產(chǎn)量卻明顯高于底物a，具體原因還有待進(jìn)一步研究，可能是由于超聲波的作用改變了纖維素與半纖維素間的結(jié)構(gòu)，使得經(jīng)超聲波/堿處理的底物更易被綠色木霉降解為還原糖。

表2 木薯稈的糖化殘?jiān)饕瘜W(xué)成分Table 2 Main chemical components of saccharification residue in cassava straw

另外，將表2與表1對(duì)比得到，微波/堿處理方法得到的底物c的水解率最高，因此可以說(shuō)在這三種預(yù)處理方法中，微波/堿處理是最佳的預(yù)處理方法，而2%（m/m）NaOH溶液微波/堿處理40 min是最佳的堿處理?xiàng)l件。

3 結(jié)論

3.1 隨著化石能源（石油和煤炭等）的日益匱乏，人們將關(guān)注的目光轉(zhuǎn)向了可替代其的能源-生物能源[12,13]。而木質(zhì)纖維素的大量存在以及低廉的價(jià)格，使其成為新一代生物能源（包括燃料乙醇）原料研究的主要方向[14]。木薯秸稈木薯工業(yè)的廢棄產(chǎn)物，被大量堆積或者用于生產(chǎn)菌類，不僅能源利用度低，還會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染。故而，本文以木薯秸稈為原料，研究其原料預(yù)處理以及降解產(chǎn)糖的工藝，為發(fā)展工業(yè)化降解木薯秸稈提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。在木薯秸稈里，木質(zhì)素與半纖維素之間形成了穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，其嚴(yán)重地阻礙了纖維素的降解，故必須在水解前進(jìn)行預(yù)處理工藝。但由于半纖維素易于去除，因而一般將木質(zhì)素作為影響纖維素水解的最主要因素。同時(shí)，在選擇預(yù)處理方法是還應(yīng)注意其他碳水化合物損失的多少以及性價(jià)比。目前，預(yù)處理技術(shù)主要包括物理、物理化學(xué)、化學(xué)、生物以及組合預(yù)處理法等。

3.2 本文研究三種不同預(yù)處理工藝（常規(guī)堿、微波/堿和超聲波/堿），并以重量損失、處理后的化學(xué)組分、還原糖產(chǎn)量為重要指標(biāo)以確定最佳操作條件為2%NaOH微波/堿處理40 min，經(jīng)該工藝處理得到的底物經(jīng)分步糖化發(fā)酵得到的還原糖產(chǎn)量為3.38 mg還原糖/g木薯秸稈，同時(shí)其產(chǎn)糖率比未優(yōu)化的1.74 mg還原糖/g木薯秸稈增加了94.25%。微波/堿處理與超聲波/堿處理和常規(guī)堿處理相比，可以去除更多的半纖維素和較多的木質(zhì)素，這使得微波/堿處理得到的底物經(jīng)綠色木霉降解可得到最高的還原糖產(chǎn)量，而木薯稈的糖化殘?jiān)饕瘜W(xué)成分的分析也證明了這一點(diǎn)，因此，可以說(shuō)微波/堿處理是最佳的預(yù)處理方法。另一方面，堿濃度和處理時(shí)間的增加可導(dǎo)致纖維素含量和重量損失均在不斷增加，但這種增加的程度卻在不斷降低，因此，考慮到后續(xù)處理工藝及環(huán)境影響的因素，選擇2%（m/m）NaOH溶液微波/堿處理40 min為最佳的堿處理?xiàng)l件。

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