脈沖電場協(xié)同酶法制備淀粉鋅絡(luò)合物及其顯微結(jié)構(gòu)的研究

韓忠，王金花，成軍虎，曾新安

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州廣東 510640）（2.廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點實驗室，廣州廣東 510640）

多孔淀粉（porous starch）是一種新型、環(huán)境友好型的天然多孔性材料，具有原料來源廣泛、成本低、綠色環(huán)保、較大的比表面積、較低的堆積密度與良好的吸附性能等諸多優(yōu)點，被廣泛地應(yīng)用到化工工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)與農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，引起了國內(nèi)外研究者的高度關(guān)注[1,2]。目前，用來制作多孔淀粉的原料主要是谷類淀粉和根莖類淀粉，而作為全世界尤其是亞洲地區(qū)主食之一的大米，其相關(guān)研究較少。亞洲人飲食相對而言多菜少肉，造成普遍的鋅攝入量不足、吸收不良或者遺傳缺陷；而鋅元素是人體生理功能所需量僅次于鐵排名第二的微量元素，它是機體酶的重要組成成分，間接地調(diào)控著基因的表達、免疫、細胞分化和機體生長等生命過程[3～5]。因此，從日常飲食中適當?shù)匮a充鋅元素及在食品工業(yè)中添加鋅強化劑都是必不可少的。

高壓脈沖電場技術(shù)（Pulsed Electric Fields，PEF）是一種對兩電極間的流態(tài)食品反復(fù)施加高場強的短脈沖進行處理的技術(shù)，屬于非熱物理技術(shù)，能在有效保存食品天然理化性質(zhì)的同時達到滅菌的效果[6]，近來又被用于大分子物質(zhì)的修飾改性、天然活性成分的提取和化學(xué)反應(yīng)強化等方面[7～10]。從化學(xué)反應(yīng)的角度來看，脈沖電場能夠有效地降低各種反應(yīng)所需的活化能，促進金屬離子的螯合效率、淀粉酯化反應(yīng)效率和美拉德反應(yīng)初級階段等[11～14]。因此，本文擬采用傳統(tǒng)環(huán)保的雙酶協(xié)同法制備具有強吸附性能的大米多孔淀粉[15]，并借助高壓脈沖電場促進鋅元素與多孔的吸附絡(luò)合反應(yīng)，以達到高效富集鋅元素的研究目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金龍魚南方優(yōu)質(zhì)絲苗米，益海嘉里糧油食品有限公司；大米淀粉參考Lumdubwong[16]方法改進優(yōu)化制得；豬胰酶（Cat.No.P7545，活力8×USP/mg），美國Sigma-Aldrich公司；淀粉葡萄糖苷酶（Cat.No.A7095，活力300 Unit/mL），美國Sigma-Aldrich公司；乙酸鋅，廣州化學(xué)試劑廠，分析純。

1.2 主要儀器

SY-2-500型脈沖電場處理裝置，華南理工大學(xué)脈沖電場課題組自制；VECTOR33型紅外光譜儀，德國Bruker公司；S3700型掃描電子顯微鏡日本日立公司；日立Z-2000塞曼原子吸收分光光度儀，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 雙酶法協(xié)同制備大米多孔淀粉

稱取一定量大米淀粉，置于100 mL離心管中，加入一定量pH值為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（固液比1:4），置于溫度為50 ℃的振蕩水浴鍋中預(yù)熱20 min。精確移取一定配比的兩種酶加入淀粉懸濁液中，振蕩，開始計時，經(jīng)過一定時間，加入一定量4%氫氧化鈉溶液滅酶。淀粉乳離心(5000 r/min，離心10 min)后，吸取1 mL上清液于25 mL的比色管測定吸光度。下層淀粉固體用蒸餾水洗滌、離心三次(5000 r/min，離心10 min)，在45 ℃的條件下干燥24 h，之后用粉碎機對淀粉進行粉碎，過100目篩，得到多孔淀粉樣品，置于封口袋中保存。

1.3.2 淀粉水解率的測定

吸取1 mL樣品于25 mL的比色管中，然后加入2.00 mL DNS溶液?；靹蚝?，置于沸水浴中顯色2 min，然后迅速冷卻至室溫，并用蒸餾水定容到25 mL，搖勻。用準備好的空白液（1 mL緩沖液，2 mL DNS，同上述處理）調(diào)零，在540 nm波長下用1 cm比色皿測定吸光度，計算水解率。

式中，C-離心后上清液還原糖濃度，（mg/mL）；N-樣品稀釋倍數(shù)；V-反應(yīng)體系中液相體積，（mL）；0.9-從葡萄糖到淀粉的轉(zhuǎn)化系數(shù)；W-反應(yīng)前底物重量，（mg）。

1.3.3 吸油率的測定

精確稱量離心管質(zhì)量m1（g），稱取1 g左右淀粉置于離心管中，精確稱取其質(zhì)量m2（g），恒溫下與5 mL色拉油攪拌混合20 min，在5000 r/min下離心20 min，棄去上清液，精確稱量淀粉質(zhì)量為m3（g）。按以下公式計算吸油率（%）：

1.3.4 脈沖電場協(xié)同大米淀粉鋅絡(luò)合物的制備

稱取10 g原淀粉（或多孔淀粉）與500 mL的乙酸鋅溶液（0.1 mol/L）混合于燒杯中，并置于磁力攪拌水浴鍋進行攪拌，在室溫下將懸濁液泵入到脈沖電場處理室進行處理（電壓20 V、脈寬40 μs、頻率1 kHz、流速24 mL/min，有效處理時間分別為2.88×103μs、8.64×103μs、14.4×103μs）后，將懸濁液離心（5000 r/min），棄去上清液，下層淀粉固體用蒸餾水反復(fù)洗滌并離心三次后，置于45 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h，粉碎即得大米多孔淀粉鋅絡(luò)合物樣品。

1.3.5 淀粉鋅絡(luò)合物的鋅含量的測定

稱取淀粉鋅絡(luò)合物約1～5 g于馬福爐中灰化，0.5 mol/L的硝酸溶液定容后進行火焰原子吸收光譜法測定。

1.3.6 淀粉鋅絡(luò)合物結(jié)構(gòu)測定

掃描電鏡法（SEM）、紅外光譜法(FT-IR)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解率與比表面積及吸油率之間的關(guān)系

比表面積的大小決定著物質(zhì)的吸附性能，比表面積越大吸附性能就越強，秦瑩采用灰色關(guān)聯(lián)度分析，得出了可以通過水解率的測定推測比表面積的變化情況的結(jié)論[17]，但是比表面積與多孔淀粉的吸附性不具有絕對的正相關(guān)性。因此，我們采用水解率和吸油率雙重指標來衡量多孔淀粉吸附性的優(yōu)劣。聶麗紅等通過測定不同水解率多孔淀粉的比表面積，探究多孔淀粉水解率與比表面積的關(guān)系以及水解率與吸油率的關(guān)系[18]，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 水解率與吸油率及比表面積之間的關(guān)系Fig.1 Relationship between the hydrolysis rate (oil-absorption rate) and the specific surface area

由圖1可知，隨著水解率的上升，比表面積增大，在水解率達到30%以后，比表面積呈現(xiàn)較大增長，這是由于酶解導(dǎo)致淀粉顆粒粒度減小與小孔徑增大的雙重結(jié)果，但這只能體現(xiàn)淀粉水解產(chǎn)生還原糖的量，卻不能完全體現(xiàn)成孔吸附性能的好壞。因此，我們再結(jié)合吸油率來表征多孔淀粉的吸附性能。隨著水解率的上升，形成的空腔的體積越大，多孔淀粉的吸油率上升，當水解率為50%～55%時，多孔的空腔體積達到了淀粉顆粒的一半，此時吸油率最高；在水解率接近60%的時候，多孔淀粉的吸油率呈急劇下降趨勢，意味著多孔淀粉的孔結(jié)構(gòu)出現(xiàn)崩塌，失去多孔淀粉本身穩(wěn)固的機械性質(zhì)，吸附性能減弱。

2.2 復(fù)合酶法制備大米微多孔淀粉工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 酶含量對水解率和吸油率的影響

圖2 酶含量對水解率和吸油率的影響Fig.2 Effects of enzyme content on the hydrolysis rate and oil-absorption rate

在底物濃度為20%（m/m），反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)時間12 h，pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，酶配比（α-淀粉酶：葡萄糖苷酶）為1:12的實驗條件下，研究酶含量（0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）對水解率和吸油率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著酶含量的增加，水解率不斷上升，吸油率先上升后下降，在酶含量為1.0%時，多孔淀粉水解率達到50%，孔空腔體積接近淀粉顆粒體積的一半，此時，吸油率達到最大。此后，隨著水解率的增大，吸油率呈現(xiàn)下降趨勢，與圖1結(jié)果一致，由于淀粉水解過度導(dǎo)致的多孔結(jié)構(gòu)崩塌所致，因此，制備多孔淀粉的最佳酶含量為1.0%。

2.2.2 酶配比對水解率和吸油率的影響

圖3 酶配比對水解率和吸油率的影響Fig.3 Effects of the enzyme ratio on the hydrolysis rate and oil-absorption rate

在底物濃度為20%（m/m），反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)時間12 h，pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，酶含量為1.0%的條件下，研究酶配比（α-淀粉酶：葡萄糖苷酶）對水解率和吸油率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在酶配比為1:8時，水解率超出50%，淀粉結(jié)構(gòu)被破壞，吸油率較低，當酶配比為1:12時，水解率達到50%左右，多孔淀粉吸油率達到峰值。酶配比的變化導(dǎo)致水解率和吸油率的變化主要是由于兩種酶之間存在著協(xié)同作用，α-淀粉酶是采用隨機切斷糖鏈內(nèi)部的α-1,4-鏈的水解方式，當其比例較高時就容易出現(xiàn)水解過度、成孔不均的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致多孔淀粉的吸油率降低；所以，選擇適宜的酶配比對多孔淀粉的成孔均勻性起著至關(guān)重要的作用，因此，制備多孔淀粉的最佳酶配比（α-淀粉酶:葡萄糖苷酶）為1:12。

2.2.3 酶解時間對水解率和吸油率的影響

圖4 酶解時間對水解率和吸油率的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time on the hydrolysis rate and oil-absorption rate

在底物濃度為20%（m/m），反應(yīng)溫度50 ℃，酶配比（α-淀粉酶：葡萄糖苷酶）為1:12，pH 4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，酶含量為1.0%的條件下，研究處理時間（8 h、10 h、12 h和14 h）對水解率和吸油率的影響。由圖4可知，隨著酶解時間的增加，水解率逐漸增大，而吸油率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當酶解時間為12 h時，水解率為50%左右，吸油率達到峰值.當酶解時間增加到14 h時，水解率繼續(xù)增加，但吸油率已出現(xiàn)快速下降，這說明長時間的酶解導(dǎo)致多孔淀粉結(jié)構(gòu)崩塌。因此，制備多孔淀粉的最佳酶解時間為12 h。

2.2.4 正交優(yōu)化多孔大米淀粉的制備

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9(33)正交試驗來考察酶含量、酶配比和酶解時間對多孔淀粉吸油率的影響，正交實驗水平因素表如表1所示。

由表2可知，三個因素對淀粉水解率的影響主次順序依次為：酶含量>酶配比>酶解時間，最佳條件為A2B2C2，三個因素對淀粉吸油率的影響主次順序依次為：酶解時間>酶配比>酶添加量，最佳條件為A2B2C2，綜上所述，雙酶協(xié)同制備大米多孔淀粉工藝的最佳條件為A2B2C2，即酶含量1.0%，酶配比（α-淀粉酶：葡萄糖苷酶）1:12，酶解時間12 h。經(jīng)驗證實驗得：最佳條件下可制得水解率50%、吸油率96.3%的大米多孔淀粉。

表1 正交實驗水平因素表Table 1 Orthogonal experiment level factors

表2 正交實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment design and results

2.3 脈沖電場協(xié)同制備大米多孔淀粉鋅絡(luò)合物

圖5 不同脈沖電場處理時間對淀粉鋅絡(luò)合量的影響Fig.5 Effects of PEF treatment time on the znic content of starch-Zn complex

由圖5可知，原淀粉本身的鋅含量非常少，且隨著電場處理時長的增加，淀粉的鋅絡(luò)合量呈現(xiàn)逐步增加的趨勢，很明顯地體現(xiàn)了脈沖電場處理對鋅絡(luò)合反應(yīng)的促進作用。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因有二，其一為電場本身的電擊穿作用導(dǎo)致的淀粉表面破損，使得參與金屬離子絡(luò)合反應(yīng)的比表面積增大；其二，脈沖電場具有產(chǎn)生瞬時高能的作用，可以促使淀粉顆粒無定型通道的張開，從而牽引鋅離子進入淀粉顆粒內(nèi)部進行絡(luò)合配位反應(yīng)。

其中，從脈沖電場強化不同水解率的多孔大米淀粉的鋅絡(luò)合反應(yīng)來看：40%水解率、電場處理2.88 ms的多孔淀粉鋅絡(luò)合物中鋅含量最高，其次是30%水解率、電場處理8.64 ms的多孔淀粉鋅絡(luò)合物，50%水解率、電場處理2.88 ms的多孔淀粉鋅絡(luò)合物中鋅含量最低；40%水解率的多孔淀粉鋅絡(luò)合物中鋅含量都高于50%水解率淀粉的，且隨著電場處理時間的增加而減少；這是由于低水解率的多孔淀粉具有多孔吸附和高無定形區(qū)金屬離子配位點的雙重特點所致，此外高水解率的多孔淀粉孔隙結(jié)構(gòu)機械強度相對較低，在強電場作用下容易出現(xiàn)崩塌，從而導(dǎo)致其鋅離子絡(luò)合能力降低[20,21]。

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2.4 脈沖電場協(xié)同制備大米多孔淀粉鋅絡(luò)合物的形態(tài)觀察

圖6 掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy photographs

時間的增加，淀粉顆粒表面變得粗糙甚至出現(xiàn)一些坑洞。圖6e～f分別為40%水解率的多孔淀粉在脈沖電場（2.88 ms和8.64 ms）協(xié)同下進行鋅絡(luò)合反應(yīng)之后的掃描電鏡圖由圖可知，酶解淀粉具有更多的空隙，這是雙酶協(xié)同水解淀粉顆粒的無定形區(qū)的結(jié)果[19]，同時，比表面積的增大有助于其對鋅元素的吸附及脈沖電場的強化絡(luò)合作用。但隨著脈沖電場處理時間的增加，相同水解率的淀粉空隙出現(xiàn)部分崩塌，與結(jié)果2.3中40%水解率的多孔淀粉在脈沖電場處理下，時間越長、鋅絡(luò)合量越低相符合。

2.5 大米多孔淀粉鋅絡(luò)合物的紅外光譜分析（FT-IR）

圖7 大米淀粉及不同處理條件下淀粉鋅絡(luò)合物的紅外衍射圖Fig.7 Infrated diffraction patterns of rice starch and starch-Zncomplex with different treatments

紅外光譜分析能夠有效的鑒別有機物中的官能團，圖7分別為原淀粉、原淀粉鋅絡(luò)合物、40%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡(luò)合物，50%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡(luò)合物的紅外光譜圖。

淀粉的結(jié)構(gòu)特征在紅外光譜圖中的紅外吸收峰位置及結(jié)構(gòu)歸屬分別為：3377 cm-1為氫鍵締合的O-H伸縮振動，該峰寬而強；2931 cm-1為CH2的C-H不對稱伸縮振動吸收峰；1643 cm-1為H20的彎曲振動吸收峰；1340 cm-1～1500 cm-1為CH2的彎曲振動吸收峰；1150 cm-1～978 cm-1主要歸屬于淀粉各羥基的C-O伸縮振動和環(huán)醚C-O-C吸收峰；1018 cm-1、1081 cm-1和1157 cm-1分別是伯醇、仲醇和叔醇的C-O伸縮振動吸收特征峰；578 cm-1、761 cm-1和854 cm-1等處是-CH2的搖擺振動吸收特征峰。

原淀粉、原淀粉鋅絡(luò)合物、40%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡(luò)合物和50%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡(luò)合物的紅外圖譜吸收峰大部分是相同的，說明基本骨架相同。與原淀粉相比，原淀粉鋅絡(luò)合物淀粉、經(jīng)脈沖電場作用的多孔淀粉鋅絡(luò)合物與乙酸鹽作用主要影響羥基伸縮振動，伯醇的C-O伸縮振動吸收特征峰移動明顯，而仲醇C-O伸縮振動吸收特征峰和叔醇C-O伸縮振動吸收特征峰變化不明顯，說明Zn與淀粉羥基相互作用，伯醇OH參與反應(yīng)，仲、叔醇-OH可能參與反應(yīng)。與原淀粉相比，淀粉鋅絡(luò)合物的羥基伸縮振動變化明顯，說明鋅離子與淀粉羥基基發(fā)生反應(yīng)。

3 結(jié)論

3.1 以水解率和吸油率為指標，通過單因素與正交試驗得到了多孔大米淀粉最優(yōu)工藝條件：酶含量1.0%、酶配比1:12、酶解12 h，此時，多孔大米淀粉的水解率為50%，吸油率為96.3%。同時，利用脈沖電場處理強化多孔淀粉鋅絡(luò)合反應(yīng)，結(jié)果顯示：水解率40%的多孔大米淀粉經(jīng)脈沖電場（2.88×103μs）處理后的鋅絡(luò)合含量最高，為352.85 mg/100 g。

3.2 借助掃描電鏡可觀察到：酶解使淀粉呈現(xiàn)隨機性的多孔，脈沖電場進一步加強了原淀粉與30%和40%水解率淀粉多孔的形成與吸附能力，而水解率達到50%的多孔淀粉在脈沖電場的處理下會出現(xiàn)空隙崩塌，導(dǎo)致其鋅絡(luò)合量下降。紅外光譜顯示：淀粉鋅絡(luò)合物相對于原淀粉而言，羥基伸縮振動變化明顯，說明鋅離子與淀粉羥基發(fā)生了配位反應(yīng)。

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