急性心肌梗死與穩(wěn)定型心絞痛病人高密度脂蛋白膽固醇對內(nèi)皮功能的影響

，

高密度脂蛋白膽固醇(high- density lipoprotein，HDL- C)因其可逆轉(zhuǎn)膽固醇、保護內(nèi)皮細胞、抗氧化、抗炎、抗凝、促進受損的內(nèi)皮細胞愈合等作用而具有潛在的抗冠狀動脈粥樣硬化作用[1- 2]。但是，多中心臨床試驗研究結(jié)果顯示提高HDL- C水平并沒有起到所預(yù)期的抗冠狀動脈粥樣硬化作用[3- 4]。HDL- C水平并不能作為預(yù)防冠狀動脈粥樣硬化的唯一參考指標。冠狀動脈痙攣與內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)，而且冠狀動脈痙攣與冠狀動脈狹窄和急性心肌梗死所致的嚴重心血管事件呈正相關(guān)[5- 6]。本研究以急性心肌梗死(acute myocardiai infarction，AMI)和穩(wěn)定型心絞痛(stable angina，SA)病人為研究對象，對比兩者體內(nèi)HDL- C對內(nèi)皮功能影響的差異，以進一步明確HDL- C功能在抗動脈粥樣硬化中的重要性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 AMI組和SA組病人各25例，為2015年6月—2015年12月就診于延安大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科病人。AMI組年齡30歲～52歲(38.52歲±8.46歲)；SA組年齡32歲～55歲(40.64歲±9.26歲)。排除糖尿病、高血壓、嚴重感染性疾病、腎衰等疾病。對照組(C組)為來延安大學(xué)附屬醫(yī)院體檢的28名健康志愿者，年齡35歲～ 50歲( 41.42歲±7.57歲。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究已通過延安大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 血漿HDL- C提取 按文獻描述[7]，采用梯度離心法提取HDL- C：入院時即刻抽取病人空腹靜脈血離心離心(4℃，4 000 r/min，10 min)后將加入1∶500 的EDTA(Sigma- Aldrich，134 mmol/L)和1∶10 000 的BHT(Sigma- Aldrich，200 mmol/L)的血漿移入預(yù)冷的超高速管(38 mL，Beckman coulter公司)混勻后依次進行3次離心(4℃，50 000 r/min，21 h)。第一次離心后血漿由上至下分為：乳糜顆粒(CM，乳白色)、水、低密度脂蛋白(LDL，淺橘黃色)、高密度脂蛋白(亮綠色)、雜質(zhì)(深橘黃色)。第二次離心后血漿由上至下分為：LDL(淺橘黃色)、1.063密度液、HDL(亮綠色)、雜質(zhì)(深橘黃色)。第三次離心后血漿由上至下分為：HDL(亮綠色)、1.21密度液、雜質(zhì)(深橘黃色)。每次離心后均將HDL抽取用0.22 μm的濾器(MerkMillipore公司)過濾，過濾后的HDL用BCA蛋白濃度測定試劑盒(Thermo Scientific 公司)測定HDL蛋白濃度后放4℃冰箱備用(提好的HDL需3周內(nèi)用完)。

1.3 HDL對內(nèi)皮細胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達的檢測 取4代臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs，Scien Cell公司)種植于6孔板，待內(nèi)細胞密度>95%后孵育HDL- C。試驗分空白組(blank組，不處理)、C組(加對照組HDL- C，100 μg/mL)、SA組(加SA組HDL- C，100 μg/mL)、AMI組(加AMI組HDL- C，100 μg/mL)。孵育12 h后用RIPA細胞裂解提取細胞蛋白，超聲破碎儀(20 Hz 20 s)充分破碎后離心(4℃，12 000 r/min離心 10 min)，取上清用BCA蛋白濃度測定，蛋白濃度后，行Western檢測內(nèi)皮細胞eNOS及其磷酸化位點S1177表達變化。

1.4 HDL- C對內(nèi)皮細胞一氧化氮(NO)水平的檢測 取4代HUVEC種植于24孔板內(nèi)，待內(nèi)細胞密度>95%后進行HDL- C孵育。分空白組(blank組，不處理)、陽性對照組(Vascular endothelial growth factor，VEGF，50 ng/mL，R&D公司)、C組(加對照組HDL- C，100 μg/mL)、SA組(加SA組HDL- C，100 μg/mL)、AMI組(加AMI組HDL，100 μg/mL)。孵育30 min后棄取去細胞上清，并用含鈣鎂的HBSS清洗細胞3次，吸凈殘余的HBSS后向細胞內(nèi)加入500 μL含鈣鎂的HBSS(含L- arginine 25 mM)再次刺激細胞30 min后吸取細胞上清用來測定NO，按南京建成一氧化氮試劑盒說明書步驟檢測各組NO含量，記錄數(shù)據(jù)以供后續(xù)分析。各組細胞用RIPA裂解液提取蛋白，并用BCA法測量蛋白濃度用來換算最終每克細胞蛋白的NO產(chǎn)量。

1.5 HDL- C對內(nèi)皮細胞氧自由基(O2·-)水平的檢測 取4代HUVEC種植于48孔板內(nèi)，待細胞密度>95%后一半細胞首先加eNOS通路抑制劑N- 硝基- L- 精氨酸甲酯(L- NAME，1 mmol，SIGMA公司)預(yù)先孵育細胞30 min后在行HDL- C孵育。實驗分組：空白組(blank組，不處理)、陽性對照組(Hydrogen peroxide solution，H2O2，0.26 mM，SIGMA公司)、C組(加對照組HDL- C，100 μg/mL)、SA組(加SA組HDL- C，100 μg/mL)、AMI組(加AMI組HDL- C，100 μg/mL)。孵育30 min后向細胞內(nèi)加入含有光澤精(lucigenin，5 μM，SIGMA公司)的Kreb’s液再次孵育細胞5 min后用酶標儀(SpectraMax M5/M5e multi- detection reader，Molecular Devices)檢測相對發(fā)光強度(relative luminescence units，RLU)反應(yīng)氧自由基含量。測完后將各孔細胞用RIPA裂解液提取蛋白并用BCA法測量蛋白濃度以換算最終O2·-量(RLU / sec / mg 蛋白)，記錄數(shù)據(jù)以供后續(xù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組臨床資料比較 對照組、SA組及AMI組在年齡、性別、體重指數(shù)上無統(tǒng)計學(xué)意義，但SA組及AMI組的血漿脂蛋白水平普遍較對照組偏高。詳見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2 HDL- C對內(nèi)皮細胞eNOS表達的影響 與空白組比較，C組HDL- C促進內(nèi)皮細胞eNOS(見圖1A)及其磷酸化位點S1177的表達有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1B)；與C組HDL- C比較，SA組HDL促進eNOS及其磷酸化位點S1177表達的能力有所降低，但兩組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖1)；與空白組比較，AMI組HDL- C抑制了eNOS(P<0.05，見圖1A)及其磷酸化位點S1177的表達(P<0.05，見圖1B)。與空白組比較，C組和SA組的HDL- C均促進內(nèi)皮細胞eNOS的表達，AMI組HDL- C抑制了內(nèi)皮細胞eNOS的表達。與空白組比較，C組和SA組的HDL- C均促進內(nèi)皮細胞eNOS的磷酸化位點S1177的表達，AMI組HDL抑制了內(nèi)皮細胞eNOS的磷酸化位點S1177的表達。

與Blank組比較，* P<0.05。

2.3 HDL對內(nèi)皮細胞NO水平的影響 圖2A可見，與空白組比較，VEGF明顯促進內(nèi)皮細胞NO的含量升高(P<0.05)，提示本次試驗有效可信；C組和SA組HDL也較空白組促進內(nèi)皮細胞NO的產(chǎn)生(P<0.05)，雖然SA組較C組促進NO產(chǎn)生的能力有所減弱，但二者無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AMI組非但沒有促進NO的產(chǎn)生，反而抑制了NO的生成(P<0.05)。

2.4 HDL- C對內(nèi)皮細胞O2·-水平的影響 與空白組比較，H2O2明顯促進內(nèi)皮細胞O2·-的產(chǎn)生(P<0.05)，提示本次試驗有效可信；C組HDL- C一定程度上抑制了內(nèi)皮細胞O2·-的生成(P<0.05)；SA組對內(nèi)皮細胞O2·-的含量無明顯影響(P>0.05)；AMI組HDL明顯刺激了O2·-的產(chǎn)生(P<0.05)。由AMI組刺激生成的O2·-可以很大程度上被eNOS通路抑制劑L- NAME所阻斷(P<0.05)，提示AMI組HDL主要是通過eNOS信號通路來影響O2·-的含量的(見圖2B)。 C組、SA組HDL- C均促進內(nèi)皮細胞NO的產(chǎn)生，AMI組HDL- C抑制內(nèi)皮細胞NO的生成。 C組HDL- C抑制內(nèi)皮細胞O2·-的產(chǎn)生，AMI組HDL刺激內(nèi)皮細胞O2·-的產(chǎn)生，SA組HDL對內(nèi)皮細胞的O2·-含量無影響。AMI組HDL刺激生成的O2·-可以很大程度上被L- NAME阻斷。

圖2 各組HDL- C對內(nèi)皮細胞NO及O2·-含量的影響

3 討 論

本研究通過梯度離心提取健康志愿者(對照組)、AMI病人(AMI組)和SA病人(SA組)的HDL- C，對比三組HDL- C對內(nèi)皮功能的影響發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，SA組HDL- C對內(nèi)皮細胞eNOS、NO及O2·-的影響無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與SA組比較，AMI組HDL- C明顯抑制內(nèi)皮細胞eNOS及其磷酸化位點S1177的表達，降低NO水平和增加O2·-含量(P<0.05)。提示AMI時病人體內(nèi)HDL- C失去正常的心血管保護功效，而且還表現(xiàn)出了損害心血管功能的作用，HDL- C的這一改變可能與AMI病人體內(nèi)的特殊內(nèi)環(huán)境有關(guān)。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，HDL- C具有逆向轉(zhuǎn)運膽固醇、清除或減少氧化脂質(zhì)、抗炎、抗凝、保護內(nèi)皮細胞、修復(fù)血管內(nèi)皮、促進血管新生等功效[1- 2]。血漿低水平的HDL- C與心血管事件的高發(fā)密切相關(guān)[1]，而且對于接受他汀治療的冠心病病人，低水平的HDL- C病人在治療過程中發(fā)生心血管事件概率也較高[8- 9]。Mineo 等[10- 11]發(fā)現(xiàn)，正常的HDL- C通過Src- AKT- MAPK途徑刺激內(nèi)皮細胞中eNOS及其磷酸化位點Ser1177的表達，進而促進內(nèi)皮細胞NO的產(chǎn)生。還有研究顯示[12- 13]：HDL- C發(fā)揮其促進內(nèi)皮細胞遷移、血管內(nèi)膜修復(fù)及抗凋亡作用是通過內(nèi)皮祖細胞- PI3- P44/42- eNOS途徑起效的。本研究對照組在試驗結(jié)果中的作用也再次證實，正常HDL- C可以促進內(nèi)皮細胞eNOS及其磷酸化位點的表達，刺激NO的產(chǎn)生和抑制O2·-的生成。

AMI的病理生理包含了早期的炎癥反應(yīng)以及后續(xù)的動脈粥樣硬化斑塊破裂和血小板黏附/聚集、血栓形成和血管痙攣。這一病理過程必然導(dǎo)致嚴重心肌缺血而危及病人生命，如果有一種有些緩解或改善血管痙攣導(dǎo)致的心肌缺血必然可以有降低AMI的致死率。HDL- C因其保護內(nèi)皮細胞、修復(fù)血管內(nèi)皮、促進血管新生等功效而被廣大研究者所關(guān)注[2]，然而關(guān)于可以提升血漿HDL- C的膽甾醇酯轉(zhuǎn)運蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)抑制劑torcetrapib(托徹普)和 dalcetrapib(達塞曲匹)的多中心臨床隨機對照研究并沒有有效減少相關(guān)心血管事件的發(fā)生，反而出現(xiàn)了一些并發(fā)癥[3- 4]。由此可見，對HDL- C功能、代謝及功能成分的進一步研究是必須的，這對開發(fā)新的以HDL- C為靶向的冠心病治療方案有莫大的幫助。有研究顯示[14]，HDL- C在某些情況下可能失去其原有的保護心血管作用，甚至?xí)憩F(xiàn)出相反的功能：冠心病、糖尿病及慢性腎功能不全時HDL- C失去抗炎功能，而且還表現(xiàn)出趨炎作用。Zheng 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病病人體內(nèi)HDL- C的主要功能蛋白載脂蛋白A- I (apolipoprotein A- I)，會被其體內(nèi)的某些炎性因子如髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)修飾而失去原有抗炎功效。Sunita 等[16]研究提示，對于HDL- C功能異常且無明確冠心病人群有更高危的心血管事件發(fā)生率，也更需要服用降脂藥物來降低相關(guān)可能出現(xiàn)的風(fēng)險。因此，HDL- C水平和功能的測量在冠心病風(fēng)險評估中起著重要作用。本研究通過對比對照組、SA組和AMI組HDL- C發(fā)現(xiàn)，AMI組HDL- C抑制了內(nèi)皮細胞eNOS及其磷酸化位點S1177的表達，同時還抑制了內(nèi)皮細胞NO的產(chǎn)生和刺激了O2·-的生成。這一結(jié)果提示AMI時(AMI組)機體處于應(yīng)急狀態(tài)，而且冠脈血栓的破裂和各種炎性因子的刺激可能是導(dǎo)致HDL- C功能異常的罪魁禍首；而對于SA組，機體內(nèi)環(huán)境處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，因而與對照組比較，SA組HDL- C雖然也一定程度上抑制了內(nèi)皮細胞eNOS及其磷酸化位點S1177的表達，同時還抑制了內(nèi)皮細胞NO的產(chǎn)生和刺激了O2·-的生成，但是二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究顯示AMI病人體內(nèi)的HDL- C抑制內(nèi)皮細胞eNOS活化及NO的生成，同時刺激了O2·-的產(chǎn)生，這些生理改變必將導(dǎo)致內(nèi)皮功能損害和病情變化。因此改善HDL- C功能較提高HDL- C數(shù)量有更大的臨床意義。

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