耐鹽堿刺槐離體再生快繁體系的建立與優(yōu)化

王興翠，林桂玉，喬 寧，曹幫華

(1. 濰坊科技學院 蔬菜花卉研究所，山東 壽光 262700；2. 山東農業(yè)大學 生態(tài)與環(huán)境重點實驗室，山東 泰安 271018)

為提高耐鹽堿刺槐的快繁效率，滿足沿海及濱海鹽堿地區(qū)綠化要求，以耐鹽堿刺槐無性系“W009”和“W038”為試材，研究不同條件對耐鹽堿刺槐試管苗分化和生根的影響.結果表明：兩刺槐莖尖初代接種不定芽萌發(fā)率均好于莖段，“W009”離體莖尖不定芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1，莖段不定芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1；而適合“W038”離體莖尖和莖段不定芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)基則為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1；適合“W009”不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1，“W038”不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1；“W009”最適生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+0.1 mg·L-1IBA + 0.2 mg·L-1NAA+1.0 g·L-1活性炭；“W038” 最適生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA + 0.2 mg·L-1NAA+1.0 g·L-1活性炭.

耐鹽堿刺槐；快繁再生；分化；生根

刺槐(RobiniapseudoacaciaL.)，又名洋槐，由于其具有適應性強、生長快、抗鹽、抗旱性較好等特點，在內陸鹽堿地及濱海鹽堿地大面積種植，為鹽堿地區(qū)土壤理化性質的改良及沿海城市的綠化起到了很大作用[1-2].近年來，土地貧瘠及鹽堿化嚴重制約了濱海地區(qū)生態(tài)工程建設和經濟的發(fā)展，隨著工業(yè)化進程的加快及黃河三角洲高效生態(tài)經濟區(qū)發(fā)展的迫切要求，刺槐作為一種耐鹽堿和綠化、觀賞于一體的植物日益受到重視[3-4].傳統(tǒng)的刺槐繁殖方法多采分蘗、根插，播種育苗移栽為主，但其繁殖系數(shù)低、速度慢，且易產生性狀分離[5].植物組織培養(yǎng)技術是刺槐優(yōu)良無性系快速繁殖的重要手段之一，尤其在目前城市園林綠化和生態(tài)建設對苗木需求加大的情況下，具有更重要的實踐意義.通過莖尖、莖段、葉、形成層等組織或細胞的離體培養(yǎng)[6-10]，可在短期內獲得大量優(yōu)良的刺槐苗木，而不同外植體[11-14]、植物生長調節(jié)物質[15-16]、樹齡、瓊脂用量[17-18]等因子都會產生一定影響.總結前人研究結果得出，不同刺槐品種無論在叢生芽直接誘導分化還是經愈傷組織誘導分化所需的激素配比及濃度不同，說明不同的基因型其無性系的建立及優(yōu)化存在差異，因此針對不同刺槐品種材料有必要進行再生體系的建立及優(yōu)化.為此，筆者對部分優(yōu)良速生耐鹽堿刺槐組織培養(yǎng)及植株再生的關鍵調控因子進行研究，建立優(yōu)質高頻穩(wěn)定快繁體系，以期為沿海地區(qū)耐鹽堿刺槐苗木的周年生產供應提供參考.

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為從山東省東營市黃河三角洲實生刺槐林篩選的耐鹽性較強的“W009”、“W038”2個刺槐無性系，將其田間種植選取當年生健壯枝條的半木質化嫩莖及幼嫩莖尖為試驗材料.試驗所用植物生長調節(jié)劑NAA、6-BA、IBA均為Sigma生物試劑進口分裝產品；70%乙醇為95%乙醇(AR)稀釋配制，由天津市北辰方正試劑廠生產；升汞溶液由貴州省銅仁化學試劑廠生產的HgCl2(AR)無菌水配制而成； MS培養(yǎng)基由杭州百思生物技術有限公司生產.

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 外植體的表面滅菌

將試驗材料剪取頂部約1.5 cm幼嫩莖尖，其余部分切成1.5 cm左右的帶腋芽莖段，自來水沖洗1 h后，在超凈工作臺上分別用70%的乙醇表面消毒(40，60 s)，無菌水沖洗3～4次后，再用0.1% HgCl2加2～5滴吐溫80消毒(4，6 min)，最后用無菌水沖洗4～5次并用消毒濾紙吸干表面水分，接種到不加激素的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng).每處理3次重復，每個重復20瓶，為防止交叉感染每瓶接種1個外植體， 10 d后統(tǒng)計成活率和污染率，選擇最佳外植體.

1.2.2 初代培養(yǎng)

根據(jù)1.2.1試驗結果，幼嫩莖段經最佳消毒處理后，接種到MS+6-BA(0，0.5，1.0 mg·L-1)+NAA(0.05，0.1，0.2 mg·L-1)+瓊脂7 g·L-1+蔗糖30 g·L-1的MS培養(yǎng)基上.每個處理接種30個外植體，重復3次.20 d后統(tǒng)計腋芽的萌發(fā)率及萌發(fā)芽的生長狀況.

1.2.3 不定芽的繼代增殖培養(yǎng)

將獲得的無菌苗材料切成約1.0 cm的莖段，轉接入MS+6-BA(1.0，2.0，3.0 mg·L-1)+NAA(0.05，0.1，0.2 mg·L-1)+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1的繼代培養(yǎng)基上.每個處理接種30個外植體，重復3次.30 d后統(tǒng)計不定芽分化率和增殖系數(shù)，篩選刺槐叢生芽誘導最佳激素配方.

1.2.4 生根培養(yǎng)

將分化培養(yǎng)28 d的健壯叢生芽切分成單株(長度約1 cm)，分別接種于附加不同濃度的NAA(0.2,0.5 mg·L-1)和6-BA(0,0.1 mg·L-1)的MS和1/2 MS的生根培養(yǎng)基上誘導生根.每個處理接種30個不定芽，3次重復.培養(yǎng)20 d后，觀察生根情況并統(tǒng)計生根率、生根條數(shù)，選擇最佳濃度配比的培養(yǎng)基.在此基礎上，添加不同濃度活性炭(0～5 g·L-1)，研究其對刺槐叢生芽生根的影響.

1.2.5 培養(yǎng)條件

以上試驗，培養(yǎng)基均添加7 g·L-1瓊脂，30 g·L-1蔗糖，調節(jié)pH為5.8，于121 ℃高壓滅菌21 min.在 (25±2) ℃、光照條件為2 000 lx、光照周期為16 h· d-1的條件下進行培養(yǎng).

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

污染率(%)=已污染的外植體數(shù)/接種外植體個數(shù)×100%;萌發(fā)率(%)=萌發(fā)腋芽的外植體數(shù)/接種外植體個數(shù)×100%;分化率(%)=已分化的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%;增殖系數(shù)=不定芽分化總數(shù)/外植體個數(shù);生根率(%)=已生根不定芽個數(shù)/不定芽接種個數(shù)×100%;株平均根數(shù)=總根數(shù)/生根的不定芽個數(shù).

試驗所得數(shù)據(jù)采用Excel和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析[19]，顯著性檢驗采用鄧肯氏新復極差法.

2 結果與分析

2.1 外植體滅菌時間的選擇

以莖尖和帶腋芽的莖段作為最初外植體，接種到初始培養(yǎng)基后隨時觀察外植體污染情況，經70%乙醇和0.1%升汞經不同消毒時間組合處理后，莖段和莖尖作為外植體的污染率和成活率見表1所述.

注：表中每列數(shù)值后不同大寫字母表示處理間差異達極顯著水平(p≤0.01)，不同小寫字母表示處理間差異達顯著水平(p≤0.05).

由表1可見，莖段和莖尖作為外植體其污染率和成活率有顯著差別.以“W009”為例，隨著消毒時間的延長，莖尖和莖段污染率均呈現(xiàn)下降趨勢，但其成活率也隨之降低，雖然帶腋芽莖段污染率較莖尖低，但綜合成活率選擇，莖尖為最佳外植體選擇，70%乙醇處理40 s + 0.1%升汞處理5 min消毒效果最好，成活率達到90.0%.不同消毒滅菌處理“W038”得到的結果與“W009”的有相似的趨勢，但莖尖在70%乙醇處理60 s + 0.1%升汞處理3 min消毒后成活率達最高88.3%.

2.2 激素配比對刺槐初代培養(yǎng)不定芽萌發(fā)的影響

外植體在初代培養(yǎng)基培養(yǎng)約7 d后腋芽開始萌動，呈現(xiàn)嫩綠色，莖基部膨大隨后產生愈傷組織，12 d后腋芽基部周圍產生數(shù)量不等的叢生芽.附加低濃度的6-BA和NAA 有利腋芽的萌發(fā)，但6-BA/NAA值較低時，莖基部產生的愈傷組織較大，而較高濃度的6-BA和NAA腋芽萌發(fā)受阻，且對其生長造成影響.培養(yǎng)后期發(fā)現(xiàn)，分裂素濃度越高，雖然愈傷組織產生較少，但外植體基部腫脹程度隨分裂素濃度的增加而增大，玻璃化現(xiàn)象越嚴重，葉片呈現(xiàn)透明程度越明顯.表2列出了激素的不同配比對刺槐初代培養(yǎng)不定芽誘導萌發(fā)的影響.

表2 激素配比對刺槐初代培養(yǎng)不定芽誘導萌發(fā)率的影響 %

品種激素/(mg·L-1)莖尖莖段NAA0.020.050.10.20.020.050.10.2W0096-BA0.561.1cdCD77.8aA64.4cC52.2fEF58.9deC70.0abB65.6cBC50.0hE1.058.9deD71.1bB75.6aAB40.0hI60.0dC66.7bcB72.2aA55.6efgCDE1.550.0fFG56.7eDE58.9deD45.6gGH52.2ghDE54.5fgCDE57.8defCD43.3iF2.034.4iJ38.9hIJ40.0hI41.1hHI33.3kH37.8jGH40.0ijFG33.3kHW0386-BA0.561.1eDE72.2bAB60.0eEF50.0ghH56.7efDE65.6bB61.1cdBCD54.4fE1.065.6dCD68.9cBC76.7aA47.8ghHI60.0de64.4bcBC72.2aA45.6gF1.551.1gGH55.6fFG46.7hHI43.3iIJ56.7efDE65.6bB61.1cdBCD54.4fE2.026.7lL34.4kK38.9jJK37.8jK27.8iH43.3gF36.7hG25.6iH

注：表中每列數(shù)值后不同大寫字母表示處理間差異達極顯著水平(p≤0.01)，不同小寫字母表示處理間差異達顯著水平(p≤0.05).

由表2可知，隨著6-BA和NAA濃度的增加，刺槐初代培養(yǎng)不定芽的萌發(fā)率基本呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，激素濃度越大外植體萌發(fā)率越低，對不定芽的傷害越大，表現(xiàn)為不定芽瘦弱呈黃綠色.耐鹽堿刺槐無性系“W009”離體莖尖不定芽萌發(fā)的激素配比在6-BA 和NAA組合分別為 0.5 mg·L-1+0.05 mg·L-1和1.0 mg·L-1+0.1 mg·L-1時沒有顯著性差異，第1種組合激素用量較少且不定芽萌發(fā)率高；激素配比為6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1時，最有利于莖段不定芽的萌發(fā)，萌發(fā)率為72.2%；適合“W038”離體莖尖和莖段不定芽萌發(fā)的最佳激素配比則為6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1.

2.3 激素配比對刺槐不定芽增殖的影響

通過觀察，附加較低濃度的6-BA 和NAA，耐鹽堿刺槐無性系“W009”無菌苗色澤鮮綠且生長旺盛，隨著NAA濃度的升高，外植體基部愈傷組織體積也隨之增大；“W038”不同處理同前者有相似的表現(xiàn)，但附加較高濃度的6-BA和NAA，各處理隨著培養(yǎng)時間的增加不同程度地出現(xiàn)生長衰弱、葉片變黃脫落的現(xiàn)象.由表3～4可以看出，繼代培養(yǎng)中較低濃度的6-BA對刺槐不定芽增殖作用顯著，隨著NAA濃度的增加，刺槐不定芽分化率和增殖系數(shù)則呈現(xiàn)相反的趨勢.耐鹽堿刺槐無性系“W009”不定芽分化率和增殖系數(shù)在6-BA濃度為1.0 mg·L-1，NAA 濃度為0.05 mg·L-1時均最大，分別為88.9%和3.5；而“W038”不定芽分化率和增殖系數(shù)在6-BA濃度為2.0 mg·L-1，NAA 濃度為0.1 mg·L-1時均最大，分別為76.7%和3.8；當6-BA濃度為3.0 mg·L-1，NAA 濃度為0.2 mg·L-1時，兩耐鹽堿刺槐無性系不定芽分化率及增殖系數(shù)均達到最低值.

表3 激素配比對刺槐不定芽分化率的影響 %

品種激素/(mg·L-1)6-BA1.02.03.0W009NAA0.0588.9aA84.4bB74.4dC0.181.1cB74.4dC60.0fE0.265.6eD66.7eD57.8fEW038NAA0.0572.2bAB61.1dDE60.0dEF0.165.6cCD76.7aA68.9bcBC0.251.1fGH55.6eFG46.7gH

注：表中每列數(shù)值后不同大寫字母表示處理間差異達極顯著水平(p≤0.01)，不同小寫字母表示處理間差異達顯著水平(p≤0.05).

表4 激素配比對刺槐不定芽增殖系數(shù)的影響 %

品種激素/(mg·L-1)6-BA1.02.03.0W009NAA0.053.5aA3.0bAB1.7fgF0.12.9bBC2.7bcBCD1.5gF0.22.4cdCDE2.3deDE1.9efEFW038NAA0.053.1bBC3.4bAB2.3cdDEF0.12.6cCD3.8aA2.1deDEF0.22.1deEF2.6cCDE1.7eF

注：表中每列數(shù)值后不同大寫字母表示處理間差異達極顯著水平(p≤0.01)，不同小寫字母表示處理間差異達顯著水平(p≤0.05).

2.4 培養(yǎng)基、激素配比和添加活性炭對刺槐不定芽生根的影響

在生根培養(yǎng)中，經觀察耐鹽堿刺槐無性系“W009”在附加0.1 mg·L-1IBA + 0.2 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)至第8 天時開始誘導生根，而“W038”在附加0.3 mg·L-1IBA + 0.2 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)至第9天時開始誘導生根，且誘導產生的不定根均生長迅速，部分有側根，苗生長正常；10 d后可以看到兩耐鹽堿刺槐所有處理組合均誘導無菌苗生根，但隨著激素濃度的增大，各處理試管苗的生根表現(xiàn)為緩慢、發(fā)根量變少、根細弱，生根率下降，且試管苗莖基部有愈傷組織產生.前期誘導過程中兩耐鹽堿刺槐無性系生根數(shù)急速上升(至誘導20 d)，后期時間主要以根的生長為主，整體呈現(xiàn)急快-平緩趨勢(圖1).

圖中數(shù)值后不同小寫字母表示處理間差異達顯著水平(p≤0.05).圖1 不同時間刺槐不定芽誘導生根情況

同時可以看出(表5)，NAA和IBA 配合使用的生根效果明顯優(yōu)于單獨使用NAA的效果.以MS為基本培養(yǎng)基，耐鹽堿刺槐無性系“W009”和“W038”最佳生根濃度分別為NAA 0.2 mg·L-1+0.1 mg·L-1IBA和NAA 0.2 mg·L-1+0.3 mg·L-1IBA，生根率分別為76.7%和82.2%.以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，最佳激素濃度配比誘導生根，發(fā)現(xiàn)不定根生長迅速，根系發(fā)育好，且生根率和生根條數(shù)較MS培養(yǎng)基高，耐鹽堿刺槐無性系“W009”和“W038” 生根率和生根條數(shù)分別達80.0%、3.9條和83.3%、4.5條.由此得出，兩耐鹽堿刺槐無性系最佳生根培養(yǎng)基分別為1/2 MS+0.1 mg·L-1IBA + 0.2 mg·L-1NAA 和1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA +NAA 0.2 mg·L-1.

表5 激素配比和培養(yǎng)基對刺槐不定芽生根的影響

注：表中每列數(shù)值后不同大寫字母表示處理間差異達極顯著水平(p≤0.01)，不同小寫字母表示處理間差異達顯著水平(p≤0.05).

不同濃度活性炭(AC)對刺槐不定芽生根的影響狀況見表6所列.由表6看出，將兩耐鹽堿刺槐的叢生芽切分成單株后接種于附加蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1和不同濃度活性炭的最佳生根培養(yǎng)基上誘導生根.觀察發(fā)現(xiàn)，一定量的活性炭更有利于刺槐不定芽生根，不定芽莖基部基本無愈傷組織產生，側根增多，但隨著活性炭濃度的增大，刺槐生根率呈現(xiàn)下降趨勢，且植株生長衰弱、株高降低.兩耐鹽堿刺槐均在添加1.0 g·L-1的活性炭的生根培養(yǎng)基上誘導生根效果最好，生根率和平均生根數(shù)均較高，分別為88.9%、4.8條和99.3%、5.7條.

表6 不同濃度活性炭(AC)對刺槐不定芽生根的影響

注：表中每列數(shù)值后不同大寫字母表示處理間差異達極顯著水平(p≤0.01)，不同小寫字母表示處理間差異達顯著水平(p≤0.05).

3 討 論

3.1 外源激素對耐鹽堿刺槐不定芽分化和生長的影響

在植物離體培養(yǎng)中，外源細胞分裂素、生長素對不定芽的誘導和生長發(fā)育具有重要作用.Vain[20]證明植物生長調節(jié)劑在誘導苗再生方面的作用比植物激素本身更有效，生理活性更強.秦愛光等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1組合時，刺槐分化的不定芽最多，單個外植體分化芽數(shù)和有效芽數(shù)也最高.此外，刺槐不定芽增殖過程中，在培養(yǎng)基中加入一定配比的6-BA、IBA再配合加入TDZ及水解乳蛋白等更容易獲得不定芽，不定芽的分化率高[5].筆者的研究結果表明，耐鹽堿刺槐無性系“W009”在MS培養(yǎng)基中附加6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1有利于刺槐不定芽的誘導和增殖；而“W038”在MS培養(yǎng)基中附加6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1利于不定芽的誘導及增殖.

3.2 培養(yǎng)基及激素配比對刺槐不定芽生根的影響

相關研究表明，生根培養(yǎng)對基本培養(yǎng)基的類型要求不嚴，但培養(yǎng)基若富含N、P、K鹽會抑制根的發(fā)生，因此，需將含鹽濃度應適當稀釋或降低至更低水平[22].此外，有研究還表明在生根培養(yǎng)基中適當加大生長素的濃度，不用或少用細胞分裂素生根效果好；生長素濃度過高時容易引起愈傷組織化和抑制根的生長[21,23].田琳琳等[24]研究得出，IBA可以快速誘導無刺桅桿槐和無刺槐生根,最佳生根培養(yǎng)基均為1/2MS+IBA 0.05 mg·L-1.而對于匈牙利速生刺槐NAA的生根影響大于IBA，在NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1時不定芽生根情況較好[21].筆者的試驗研究結果表明，最佳誘導生根激素配比條件MS培養(yǎng)基較1/2 MS培養(yǎng)基兩耐鹽堿刺槐不定芽的生根率和根生長情況均較差，這與李云等[25]對刺槐生根研究的結果相似.此外，耐鹽堿刺槐無性系“W009”生根誘導試驗結果與秦愛光等[21]的研究結果基本一致，但“W038”則在NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1時誘導不定芽生根情況較好.

3.3 添加活性炭對刺槐生根的影響

在植物組織生根培養(yǎng)過程中，加入一定量(0.1%～0.5%)的活性炭對誘導生根作用明顯，它可以提供生根的暗環(huán)境，同時還能防止褐變，提高培養(yǎng)基內可溶性蛋白和總糖的含量，但活性炭濃度過高時，則會抑制生根[5]；此外，培養(yǎng)基加入活性炭，能夠促進小麥試管苗外植體正常發(fā)育[22].無性系“W009”刺槐形成層愈傷組織分化不定芽生根過程中添加活性炭能顯著改善生根質量，生根的最佳培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+AC 0.5 g·L-1 [5].該試驗研究發(fā)現(xiàn)：添加活性炭在一定范圍內對刺槐不定芽生根有促進作用，當活性炭濃度為1 g·L-1時，刺槐生根最好；濃度過高表現(xiàn)為生根率下降，雖然根長增加，但根變細，這可能與下列情況有關，即刺槐在再生快繁體系建立不同途徑中，外源生長調節(jié)物質在外植體內的積累改變了刺槐不定芽內源激素的含量；不同濃度的活性炭其吸附能力的不同改變了不同途徑中培養(yǎng)基中的生長調節(jié)物質和營養(yǎng)物質.

刺槐不定芽增殖及生根情況見圖1所示.

a: “W009”不定芽分化增殖; b1: “W009”未添加AC誘導生根時試管苗生長情況; b2: “W009”未添加AC誘導生根時根的生長情況; c1: “W009”添加1.0 g/LAC誘導生根時試管苗生長情況; c2: “W009”添加1.0 g/LAC誘導生根時根的生長情況; A: “W038”不定芽分化增殖; B1: “W038”未添加AC誘導生根時試管苗生長情況; B2: “W038”未添加AC誘導生根時根的生長情況; C1: “W038”添加1.0 g/LAC誘導生根時試管苗生長情況; C2: “W038”添加1.0 g/LAC誘導生根時根的生長情況.圖1 刺槐不定芽增殖及生根情況

4 結束語

消毒效果與刺槐外植體及殺毒時間有關，刺槐不定芽的分化、增殖及生根與基本培養(yǎng)基類型、激素水平及配比、是否添加活性炭等密切相關：兩刺槐無性系莖尖初代接種不定芽萌發(fā)率均好于莖段；MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1有利于“W009”不定芽的增殖，MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1有利于“W038”不定芽的增殖；“W009”最適生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+0.1 mg·L-1IBA + 0.2 mg·L-1NAA+1.0 g·L-1活性炭；“W038” 最適生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA + 0.2 mg·L-1NAA+1.0 g·L-1L活性炭.

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