原花青素抑制丙烯酰胺的動力學

周夢舟，丁 城，關亞飛，吳 茜,*

2002年，瑞典國家食品管理局和斯德哥爾摩大學研究發(fā)現(xiàn)：含有豐富碳水化合物的食品在高溫下加工可能會產(chǎn)生丙烯酰胺[1-2]。丙烯酰胺具有強烈的致癌性[3]，同時也具有神經(jīng)毒性[4-5]、生殖毒性[6]、遺傳毒性[7]。因此，在全世界，丙烯酰胺被廣泛研究。一些物質(zhì)已經(jīng)被確定是形成丙烯酰胺的前體物質(zhì)，主要包括脫羧希夫堿[8]、脫羧基重排物質(zhì)[9]、丙烯酸[10-11]和丙烯醛[12]等。丙烯酰胺的動力學研究可以系統(tǒng)地表征出其反應的機制，如反應前體的用量、丙烯酰胺和其他一些重要中間產(chǎn)物（如希夫堿）的形成等[13]，為進一步研究丙烯酰胺形成和抑制機理提供基礎。目前國際上關于丙烯酰胺的動力學研究已有較大進展，主要有形成-消除一級動力學模型[14-15]、機理動力學模型（Logistic-生長曲線型、Logistic-Fermi動力學模型和Logistic-指數(shù)動力學模型）[16-18]和非等溫變化動力學模型[19]，由于非等溫變化動力學模型額外考慮了溫度的變化速率對本反應的影響，使得模擬變得十分的復雜，目前也應用較少。

19世紀末，人們研究發(fā)現(xiàn)許多高等植物的葉、果、花內(nèi)的無色物質(zhì)在酸作用下生成紅色的產(chǎn)物，從而揭開了原花青素的研究序幕。原花青素能有效清除自由基[20]，增強免疫力、保護心血管、預防高血壓、抗腫瘤、抗輻射、抗突變及美容等[21-24]。同時原花青素具有強大的生物活性，并以其高效、低毒和極高的生物利用率被廣泛關注[25]。凌智群等[26]從蓮房的成熟花托中和荔枝皮中分別分離了蓮房原花青素（lotus seedpod procyanidin，LSPC）和荔枝原花青素（litchi pericarp procyanidin，LPPC），同時證明了它們具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能[27]。研究發(fā)現(xiàn)原花青素能顯著抑制丙烯酰胺的形成[28]。

因此，本實驗研究兩種原花青素對丙烯酰胺的抑制影響，選擇機理動力學的3 種模型對實驗進行擬合，選擇最佳的擬合方程，并計算得出添加原花青素后相應動力學參數(shù)的變化，評價LPPC與LSPC對動力學的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LPPC（99.56%）和LSPC（100.89%）由湖北省食品發(fā)酵工程技術研究中心室制備得到。

丙烯酰胺標準品（＞99.9%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；D-（±）-水合葡萄糖、L-水合天門冬酰胺、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醇、甲酸、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、正己烷 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；ENVITM-18固相萃取小柱（十八烷基，17%含碳量，3 mL） 美國Superclean公司；Atlantis?T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國Waters公司；0.22 μm水系針筒式微孔濾膜過濾器 上海楚柏實驗室設備有限公司；Milli-Q水純化系統(tǒng) 法國Millipore公司；冷凍離心機 德國Eppendorf公司；萬分之一電子天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 類黑精濃度和丙烯酰胺質(zhì)量濃度測定1.3.1.1 類黑精濃度測定

將反應產(chǎn)物用水稀釋10 倍后，采用紫外-可見分光光度計在470 nm波長處測定吸光度，通過Lambert-Beer定律計算樣品中類黑精的濃度（式（1）），其中類黑精的摩爾消光系數(shù)取282 L/（mol·cm）[20,29]，每組實驗重復3 次。

式中：c為類黑精的濃度/（mmol/L）；A為吸光度；V為樣品定容體積/mL；ε為類黑精的摩爾消光系數(shù)（282 L/（mol·cm））；b為比色皿寬度/cm。

1.3.1.2 丙烯酰胺質(zhì)量濃度測定

采用高效液相色譜檢測，色譜條件：色譜柱Atlantis?T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：V（甲醇）∶V（0.1%甲酸水溶液）＝5∶95；流速：1 mL/min；檢測柱溫：30 ℃；檢測波長：205 nm；進樣量：20 μL。

1.3.2 葡萄糖-天冬酰胺動力學反應體系的構建

用pH 8.0的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，分別配制0.2 mol/L的天冬酰胺（asparagine，Asn）溶液和0.2 mol/L的葡萄糖（glucose，Glu）溶液，向不銹鋼密封試管中分別加入500 μL Asn溶液和500 μL Glu溶液，構成0.1 mol/L的Glu-Asn模擬體系，設置空白對照組和原花青素實驗組，在實驗組向體系中分別加入0.5 mg/mL LPPC和0.1 mg/mL LSPC溶液，在空白對照組中加入相同體積的磷酸鹽緩沖液，密封置于180 ℃恒溫油浴鍋中分別反應5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 min后取出，迅速冰浴阻止其繼續(xù)反應，各實驗重復3 次。

1.3.3 動力學反應模型的構建

1.3.3.1 Logistic-生長曲線模型的構建

對Logistic-生長曲線模型而言，體系中丙烯酰胺的含量分別用兩個不同階段表示，即將生成和消除看作兩個不同的時段，而不是一個可逆的整體反應（即看作一個分段函數(shù)）。Cf（t）表示丙烯酰胺含量上升時的變化量/（μmol/mol Asn），Ce（t）表示丙烯酰胺含量下降時的變化量（μmol/mol Asn），動力學方程如式（2）、（3）所示[17]。

式中：Af和Ae分別代表與丙烯酰胺在生成和消除時的溫度依賴系數(shù)/（μmol/mol Asn）；kf和ke分別代表形成和消除過程中與溫度相關的陡度參數(shù)/min-1；tf和te分別代表形成和消除過程中與溫度相關的拐點處時間/min；t為反應時間/min。

1.3.3.2 Logistic-Fermi動力學模型的構建

對于Logistic-Fermi動力學模型而言，Cf（t）表示丙烯酰胺形成過程中的含量變化（μmol/mol Asn），Ce（t）表示丙烯酰胺消除過程中的含量變化（μmol/mol Asn），Cf（t）和Ce（t）的乘積就表示整個體系中丙烯酰胺的含量變化，動力學方程如式（4）～（6）所示[13]。

式中：a代表與丙烯酰胺濃度相關的溫度依賴系數(shù)（μmol/mol Asn）；kf和ke分別代表形成和消除過程中與溫度相關的陡度參數(shù)/min-1；tf和te分別代表形成和消除過程中與溫度相關的拐點處時間/min；t為反應時間/min。

1.3.3.3 Logistic-指數(shù)動力學模型的構建

對于Logistic-指數(shù)動力學模型而言，是在Logistic-Fermi動力學模型的基礎上進行改進，即其他參數(shù)不變，將丙烯酰胺消除過程中的含量變化改成指數(shù)形式的表達，簡化了模型的參數(shù)，動力學方程如式（7）～（9）所示[18]。

式中：a代表與丙烯酰胺濃度相關的溫度依賴系數(shù)/（μmol/mol Asn）；kf和tf分別代表形成過程中與溫度相關的陡度參數(shù)和時間參數(shù)/min-1；p為特征時間/min；t為反應時間/min。

1.3.3.4 類黑精Slogistic動力學模型的構建

對類黑精Slogistic動力學模型而言，Cf（t）表示類黑精的含量變化，動力學方程如式（10）所示。

式中：af代表與丙烯酰胺濃度相關的溫度依賴系數(shù)/（μmol/mol Asn）；kf代表形成過程中的溫度依賴系數(shù)/min-1；tf代表形成過程中的溫度依賴系數(shù)/min；t為反應時間/min。

1.3.3.5 動力學模型的選擇和參數(shù)分析

對上述3 種動力學模型采用Origin 8.0軟件進行無限迭代擬合，建立最終動力學方程，得出各個動力學參數(shù)，從中選擇最佳反應模型，并計算預測值，建立預測值-實驗值的相關散點曲線，并對參數(shù)進行分析。

1.3.4 原花青素對體系丙烯酰胺生成后的影響

分別配制10 μg/mL和20 μg/mL的丙烯酰胺標準溶液，于4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

采用逐級稀釋法，分別用純水配制質(zhì)量濃度梯度為0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500 mg/mL和1.000 mg/mL的LPPC和LSPC溶液，于4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

向不銹鋼密封試管中加入1 mL丙烯酰胺標準溶液（0.2、2.0 μg/mL和20.0 μg/mL），并分別加入100 μL上述質(zhì)量濃度梯度的LPPC和LSPC溶液，設置空白對照組，空白對照組中加入等量的純水，密封置于180 ℃恒溫油浴鍋中反應30 min后取出，迅速置于冰浴阻止其繼續(xù)反應，按照1.3.1.2節(jié)所述測定丙烯酰胺質(zhì)量濃度，各實驗重復3 次。

向不銹鋼密封試管中加入1 mL的10μg/mL的丙烯酰胺溶液和100 μL的1.0 mg/mL的LPPC與LSPC溶液，設置空白對照組，空白對照組中加入等量的純水，分別于120、140、160、180、200 ℃下加熱30 min后取出，迅速置于冰浴阻止其繼續(xù)反應，按照1.3.1.2節(jié)所述測定丙烯酰胺質(zhì)量濃度，各實驗重復3 次。

1.4 統(tǒng)計學分析

動力學模型的構建用Origin 8.0軟件完成，分析利用無限迭代法，得出最優(yōu)解，并計算殘差平方和和校正平方和，進而得出pseudo-R2。

2 結果與分析

2.1 丙烯酰胺形成-消除動力學曲線的結果

圖1 模擬體系中丙烯酰胺的形成-消除動力學曲線（n＝ 3）Fig. 1 Kinetic proベles of acrylamide formation and elimination in model system (n = 3)

選取添加水平LSPC為0.1 mg/mL和LPPC為0.5 mg/mL最佳劑量進行動力學實驗。從圖1中可以看出，實驗組中丙烯酰胺的最大生成量與空白對照組相比均有不同程度的降低，LSPC組降低的幅度大于LPPC組；同時最大生成量所對應的時間也比空白對照組要延后，空白對照組、LPPC組和LSPC組丙烯酰胺的最大生成量與其時間分別為1 734.2、1 296.7、1 026.4 μmol/mol Asn和30、35、40 min；3 組實驗中丙烯酰胺的生成量到最大之后均開始降低，到加熱后期（50 min后），丙烯酰胺生成量降至幾乎相當?shù)乃健＿@種結果表明原花青素對丙烯酰胺的抑制作用主要表現(xiàn)在前期，到后期原花青素可能對丙烯酰胺已無抑制作用。

2.2 類黑精動力學曲線結果

圖2 Glu-Asn體系中空白對照組和實驗組的類黑精濃度變化的動力學曲線（n＝ 3）Fig. 2 Kinetic curves of melanoidins in control and experimental groups in Glu-Asn system (n = 3)

如圖2所示，隨著反應時間的延長，3 組實驗中類黑精濃度呈遞增趨勢，且到反應后期慢慢趨向平衡。比較實驗組和空白對照組可以看出，類黑精濃度高低順序為空白對照組＞LPPC組＞LSPC組，即從側面說明加入原花青素后美拉德反應的程度可能降低，同時LSPC組降低的程度略大于LPPC組。

2.3 動力學反應模型的擬合

2.3.1 丙烯酰胺的Logistic-生長曲線模型擬合

表1 Glu-Asn模擬體系下丙烯酰胺Logistic動力學模型參數(shù)和pseudo-R2值（n＝3）Table 1 Parameters and pseudo-R2 values of Logistic kinetic models for acrylamide in Glu-Asn model system (n= 3)

實驗最初考慮用分段函數(shù)進行模型的擬合，其Logistic-生長曲線擬合結果如表1所示。以動力學曲線最高點為界拆開，分別進行表觀的形成和消除的動力學模型擬合，其pseudo-R2值均在0.9以上，擬合度較高，但后期考慮到整個反應體系中形成和消除作為一個整體同時進行反應，將其分開考慮無法很好地解釋模型的參數(shù)，故而舍棄Logistic-生長曲線模型。

2.3.2 丙烯酰胺的Logistic-Fermi動力學模型擬合

表2 Glu-Asn模擬體系中丙烯酰胺的Logistic-Fermi動力學模型的參數(shù)及pseudo-R2值（n＝3）Table 2 Parameters and pseudo-R2values of Logistic-Fermi kinetic models for acrylamide in Glu-Asn model system (n= 3)

從表2可以看出，pseudo-R2值均大于0.97，且擬合效果較好，此外Logistic-Fermi動力學模型參數(shù)較多，可以很好地反映出丙烯酰胺的形成狀態(tài)，但是此模型中出現(xiàn)了空白對照組和LSPC組的消除動力學參數(shù)te＜0的情況，對于本實驗而言，te作為時間是不可能小于0，不符合客觀規(guī)律，故舍棄這種動力學模型。

2.3.3 丙烯酰胺的Logistic-指數(shù)動力學模型擬合

表3 Glu-Asn模擬體系中丙烯酰胺的Logistic-指數(shù)動力學模型的參數(shù)及pseudo-R2值（n＝3）Table 3 Parameters and pseudo-R2values of Logistic-exponential kinetic models for acrylamide in Glu-Asn model system (n= 3)

從表3可以看出，Logistic-指數(shù)動力學模型擬合結果中，LSPC組的kf和tf均與空白對照組存在顯著性差異（P＜0.05），LSPC的加入使得丙烯酰胺的生成速率明顯降低，最大生成量時間也顯著延長；LPPC組kf與空白對照組存在顯著性差異（P＜0.05），tf無顯著性差異，LPPC的加入也使得丙烯酰胺的生成速率明顯降低，但最大生成量時間與空白對照組相比無顯著延長；兩個實驗組的特征時間p與空白對照組相比均無顯著性差異，這表明在反應后期的消除動力學階段，兩種原花青素的添加對丙烯酰胺的抑制并無明顯效果。同時pseudo-R2值均大于0.97，說明動力學模型的擬合結果良好，適于描述本實驗中丙烯酰胺的形成-消除動力學過程。此時，建立預測-實際相關散點圖（圖3）。結果表明，空白對照組和實驗組的丙烯酰胺相關系數(shù)均在0.98以上，說明對丙烯酰胺具有較強的擬合性。

圖3 Glu-Asn模擬體系中丙烯酰胺含量的實測值與預測值的相關性散點圖Fig. 3 Scattering plots for the relationship between acrylamide experimental values and predicted values in Glu-Asn model system

2.3.4 類黑精的Slogistic動力學模型擬合

表4 Glu-Asn模擬體系中類黑精Slogistic動力學模型的參數(shù)及pseudo-R2值（n＝ 3）Table 4 Parameters and R2 values of Slogistic kinetic models for melanoidins in Glu-Asn model system (n= 3)

從表4可看出，pseudo-R2值均大于0.99，說明動力學模型擬合結果良好。實驗組的kf和tf值與空白對照組相比，均無顯著性差異。

2.4 原花青素對體系丙烯酰胺生成后的抑制作用

由于最終測定時將溶液定容至10 mL，故終質(zhì)量濃度為添加質(zhì)量濃度的1/10?？疾炝嗽ㄇ嗨夭煌砑淤|(zhì)量濃度對低、中、高3 個質(zhì)量濃度的丙烯酰胺標準品在體系中的抑制作用（表5）和不同溫度條件下原花青素對丙烯酰胺標準品的抑制作用（圖4）。體系丙烯酰胺質(zhì)量濃度為0.02、0.20 μg/mL和2.00 μg/mL，LSPC和LPPC添加質(zhì)量濃度在0.001～1.000 mg/mL時，產(chǎn)物中丙烯酰胺質(zhì)量濃度分別在0.017 0～0.018 8、0.179～0.191、1.71～2.08 μg/mL和0.017 6～0.018 6、0.179～0.193、1.79～2.05 μg/mL之間，且分別與相應空白對照組無顯著性差異（P＞0.05）；體系丙烯酰胺質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，LSPC和LPPC質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，在不同加熱溫度下，產(chǎn)物中丙烯酰胺的質(zhì)量濃度分別在0.84～0.91 μg/mL和0.85～0.90 μg/mL之間，且分別與相應空白對照組無顯著性差異（P＞0.05）。此結果證明LSPC和LPPC對丙烯酰胺的消除過程無顯著性影響，表明這2 種原花青素可能與丙烯酰胺并不發(fā)生反應，而是在丙烯酰胺的形成過程中起到抑制作用。原花青素對丙烯酰胺無消除作用，可能因為以下幾種情況：一是隨著高溫反應的進行，抗氧化劑本身的活性降低，不足以對丙烯酰胺的抑制起到影響[30]；二是原花青素可能只對丙烯酰胺在前期的生成過程中起作用，而當丙烯酰胺生成后，對其并無消除效果[13]；三是到反應后期，作為反應的前提Glu和Asn都大量減少，原花青素不能很好地與它們結合，從而對消除動力學無顯著影響。同時原花青素的添加對丙烯酰胺無消除作用，而是在丙烯酰胺的形成過程中起到抑制作用。

表5 丙烯酰胺與LSPC/LPPC在加熱反應后含量的變化（n ＝3）Table 5 Changes in acrylamide contents after reaction with LSPC and LPPC under heating conditions (n= 3)

圖4 丙烯酰胺與LSPC/LPPC在不同加熱溫度下質(zhì)量濃度變化（n＝ 3）Fig. 4 Changes in acrylamide contents after reaction with LSPC and LPPC at different heating temperatures (n = 3)

3 結 論

本實驗在180 ℃加熱30 min、pH 8.0的條件下，研究了原花青素抑制丙烯酰胺的動力學行為。結果表明：其動力學曲線的不對稱性較大，溫度控制在180 ℃有利于動力學分析的進行，反應溫度過低，動力學模型很難被準確地模擬，而溫度過高，體系反應劇烈，容易導致測定時丙烯酰胺不穩(wěn)定性加大。Logistic-指數(shù)動力學模型科學地解釋了原花青素的添加對丙烯酰胺動力學的影響。從結果可以看出，原花青素的添加使動力學模型中kf和tf與空白對照組均有顯著性差異（除LPPC組tf），說明其對丙烯酰胺的形成確實有一定的影響，這可以理解為原花青素添加之后，在前期形成動力學占主導階段，它可以使得丙烯酰胺的最大生成率降低，同時使最大生成量的時間延后。而消除動力學參數(shù)p與空白對照組相比均無顯著性差異，即對消除動力學無顯著影響，則說明在反應后期，原花青素對丙烯酰胺無抑制作用。

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