雜色云芝酸溶性多糖對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用

葛唯佳,趙 巖,圖力古爾,李 偉,郜玉鋼,祝洪艷,李 玉,包海鷹,

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)a中藥材學(xué)院，b食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118)

雜色云芝(Trametesversicolor(L.) Lloyd)，又稱彩云革蓋菌或瓦菌，是多孔菌科云芝的子實體或菌絲體[1]，發(fā)源于我國的原始森林，我國東南西北均有分布，多寄生于闊葉樹倒木和朽木上[2]；體積較小，無柄，呈覆瓦狀或蓮座狀。云芝是一種大型藥用真菌，常用于癌癥的輔助治療，商業(yè)化產(chǎn)品如云芝肝泰?，F(xiàn)代研究表明，云芝屬真菌具有很多生物活性，如抗腫瘤[3]、調(diào)節(jié)免疫[4]、抗氧化[5]、抗衰老[6]、消炎保肝[7]、鎮(zhèn)痛、降血脂[8]及抗動脈粥樣硬化[9]等。但未見有關(guān)雜色云芝抗腫瘤活性的報道，為此，本試驗以肝癌H22移植瘤小鼠為模型，研究雜色云芝酸溶性多糖在小鼠模型上的抗腫瘤活性及免疫活性表現(xiàn)，以期為其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 雄性ICR小鼠，質(zhì)量18～20 g/只，SPF級，動物合格證號：SCXK(吉)2011-0004，購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 樣品、試劑和儀器 雜色云芝(野生品，采集于吉林省長白山區(qū)，由包海鷹教授鑒定)；葡萄糖、葡萄糖醛酸(購于上海源葉)，咔唑(購于阿拉丁)，H22小鼠肝癌細胞株(購自中國科學(xué)院上海細胞所)，注射用環(huán)磷酰胺(CTX)(購于上?；顦飞锟萍加邢薰?，小鼠白細胞介素-6 (IL-6)、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α) ELISA試劑盒(購于美國R&D公司)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)測試盒(購于南京建成生物技術(shù)研究所)，其他試劑均為分析純；超凈工作臺(美國BEKMAN公司)，電子分析天平(購于常熟市百靈天平儀器有限公司)，酶標儀(美國Bio-Tek公司)，UV-6100雙光束紫外可見分光光度計(購于上海美普達公司)。

1.2 方 法

1.2.1 雜色云芝酸溶性多糖的制備 將干燥的雜色云芝用體積分數(shù)95%乙醇脫脂后，用6倍體積的鹽酸(pH=2)室溫浸泡過夜，超聲處理3次，每次3 h，過濾，合并濾液，3 500 r/min離心10 min，上清液加NaOH中和，透析，減壓濃縮，濃縮液加入3倍體積的體積分數(shù)95%乙醇醇析，沉淀反復(fù)用無水乙醇清洗，即得雜色云芝酸溶性多糖(以下簡稱“CL-A多糖”)。

1.2.2 酸溶性多糖內(nèi)中性糖、葡萄糖醛酸及蛋白含量的測定 采用苯酚-濃硫酸法測定雜色云芝酸溶性多糖中的中性糖含量，硫酸-咔唑法測定葡萄糖醛酸含量[10]，考馬斯亮藍法測定蛋白含量[11]。

1.2.3 H22皮下移植瘤小鼠模型的建立 常規(guī)方法復(fù)蘇H22小鼠肝癌細胞，取0.2 mL細胞懸液注射到小鼠腹腔內(nèi)，連續(xù)傳2代。于無菌條件下抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，用無菌生理鹽水稀釋后，1 000 r/min 離心5 min，再用生理鹽水洗滌2次，調(diào)整細胞密度為1×107個/mL，取0.2 mL瘤細胞懸液接種到健康小鼠的右腋窩皮下，3 d后長出瘤塊即為造模成功。

1.2.4 動物分組及處理 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，于接種瘤細胞懸液后第2天，把小鼠隨機分成空白對照組、模型組、治療組和CTX組，每組10只。其中，CTX組小鼠于腹腔注射環(huán)磷酰胺30 mg/kg；治療組分為高、中、低3個劑量組，分別灌胃CL-A多糖280，140和70 mg/kg；模型組灌胃等量生理鹽水；空白對照組不接種瘤細胞懸液，僅灌胃等量生理鹽水；每天給藥1次。各組連續(xù)給藥10 d，末次給藥后禁食不禁水，16 h后采血斷頸處死，收集腫瘤塊及各組織。

1.2.5 小鼠抑瘤率、臟器指數(shù)以及血清指標的測定 分別稱腫瘤塊、肝、脾和胸腺的質(zhì)量，計算抑瘤率、肝指數(shù)、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。從血液中分離出血清，用ELISA法測IL-6、TNF-α、IFN-γ含量，比色法檢測ALT、BUN和CRE水平。

抑瘤率=(模型組瘤質(zhì)量-藥物組瘤質(zhì)量)/模型組瘤質(zhì)量×100%。

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.2.6 腫瘤組織H&E染色 取腫瘤組織用體積分數(shù)10%的多聚甲醛溶液固定，梯度酒精脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片和蘇木素-伊紅(H&E)染色，光鏡觀察腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.7 腫瘤組織凋亡細胞檢測 采用TUNEL標記法，在光鏡下觀察腫瘤組織中細胞的凋亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 CL-A多糖及蛋白含量

通過測定，得出CL-A多糖內(nèi)中性糖含量為656 mg/g，葡萄糖醛酸含量為38 mg/g，蛋白含量為18 mg/g。

2.2 CL-A多糖對小鼠腫瘤生長的影響

由表1可見，CL-A多糖高、中、低劑量組能不同程度抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生長；同模型組相比，高、中劑量組和CTX組荷瘤小鼠瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。CL-A多糖高、中、低劑量組和CTX組的抑瘤率分別是55.56%，47.01%，37.52%和68.14%。

2.3 CL-A多糖對小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響

CL-A多糖對肝癌H22移植瘤小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響見表2。

表1 CL-A多糖對H22肝癌移植瘤小鼠腫瘤生長的影響Table 1 Effect of acid-soluble polysaccharides from Trametes versicolor(L.) Lloyd (CL-A) on tumor growth of H22-bearing mice(n=10)

注：與模型組相比，*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著。下表同。

Note:Compared with the model group, *indicates significant difference (P<0.05)，**indicates remarkable difference (P<0.01).The same below.

表2 CL-A多糖對肝癌H22移植瘤小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of acid-soluble polysaccharides from Trametes versicolor(L.) Lloyd (CL-A) on body weight and immune organ index of H22-bearing mice (n=10)

注：與CTX組比，△表示差異顯著(P<0.05)，△△表示差異極顯著(P<0.01)；與空白對照組比，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note:Compared with the CTX group,△ indicates significant difference (P<0.05)，△△ indicates remarkable difference (P<0.01).Compared with the normal group,# indicates significant difference (P<0.05),and ## indicates remarkable difference (P<0.01).The same below.

由表2可見，給藥10 d后，荷瘤小鼠試驗前后的體質(zhì)量和各臟器指數(shù)均發(fā)生變化，與空白對照組相比，模型組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)極顯著升高(P<0.01)。CTX作為免疫抑制劑，同模型組相比，CTX組小鼠脾指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)。與CTX組相比，CL-A多糖3個劑量組脾指數(shù)顯著或極顯著升高，胸腺指數(shù)極顯著升高，而肝指數(shù)極顯著降低，說明CL-A多糖對免疫器官有保護作用。與模型組相比，CL-A多糖高、中、低劑量組肝指數(shù)無明顯差異；脾指數(shù)僅中劑量組顯著降低(P<0.05)；胸腺指數(shù)僅高劑量組顯著升高。

2.4 CL-A多糖對小鼠血清指標的影響

由表3可見，與空白對照組相比，模型組小鼠ALT、BUN和CRE水平極顯著升高(P<0.01)，表明在腫瘤生長過程中肝功能和腎功能受損。與模型組相比，CL-A多糖高、中、低劑量組ALT、BUN、CRE水平均極顯著降低(P<0.01)，說明CL-A多糖對荷瘤小鼠的肝臟和腎臟有保護作用。

表3 CL-A多糖對肝癌H22移植瘤小鼠ALT、BUN、CRE的影響Table 3 Effect of acid-soluble polysaccharides from Trametes versicolor(L.) Lloyd (CL-A) on H22-bearing mice serum factor cells ALT,BUN,CRE(n=10)

由表4可見，與空白對照組相比，模型組小鼠IL-6水平極顯著升高(P<0.01)，IFN-γ、TNF-α水平極顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，CL-A多糖3個劑量組和CTX組IL-6水平極顯著降低(P<0.01)，IFN-γ和TNF-α水平極顯著升高(P<0.01)。

表4 CL-A多糖對肝癌H22移植瘤小鼠IL-6、IFN-γ、TNF-α的影響Table 4 Effect of acid-soluble polysaccharides from Trametes versicolor(L.) Lloyd (CL-A) on H22-bearing mice serum factor cells IL-6，IFN-γ，TNF-α(n=10) ng/L

2.5 H22荷瘤小鼠腫瘤組織的H&E染色

對小鼠腫瘤組織進行H&E染色，觀察腫瘤細胞的生長狀態(tài)，進一步判斷CL-A的抗腫瘤效果。結(jié)果表明，給藥10 d后，模型組小鼠腫瘤細胞生長狀態(tài)良好，細胞核清晰可見，呈深色(圖1-A1)。與模型組相比，CTX組腫瘤組織有大面積壞死區(qū)域，細胞數(shù)量明顯減少且排列不規(guī)則，腫瘤組織松散(圖1-A2)。CL-A多糖3個劑量組也有一定的壞死區(qū)域(圖1-A3-A5)，以高劑量組最為明顯，說明CL-A多糖有一定的促進腫瘤細胞凋亡的作用。

2.6 H22荷瘤小鼠腫瘤組織的凋亡細胞檢測

通過TUNEL法檢測腫瘤組織中的細胞凋亡情況，證實CL-A多糖可促使腫瘤細胞凋亡。由圖1可見，與模型組比較，CTX組存在大量凋亡細胞(圖1-a2)，CL-A多糖高、中、低3個劑量組都存在不同數(shù)量的凋亡細胞(圖1-a3-a5)。其中高劑量組腫瘤細胞凋亡最為明顯。

3 討 論

我國有著豐富的真菌資源，但對其認識命名的僅占3.9%[12]，藥典中記載的藥用真菌所占比重也很低，而近年來含藥用真菌的處方正逐年增加[13]，因此藥用真菌的開發(fā)越來越成為主流。本試驗通過建立H22小鼠移植瘤模型，證明CL-A多糖具有很好的抗腫瘤作用。給藥10 d后，CL-A多糖高、中、低劑量組均有一定的抗腫瘤作用，可抑制荷瘤小鼠腫瘤組織的生長，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，抑瘤率分別為55.56%，47.01%和37.52%。

免疫器官在機體發(fā)生疾病時會調(diào)節(jié)機體以對抗疾病。CTX對腫瘤細胞有很好的殺傷作用，但對機體免疫器官也會造成一定的損傷[14-16]。從荷瘤小鼠試驗前后的肝指數(shù)、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)可看出，CTX對機體的免疫器官確有損傷。與CTX組相比，CL-A多糖高、中、低劑量組對肝、脾和胸腺均有保護作用，說明CL-A多糖對荷瘤小鼠的免疫器官有一定的保護作用。與模型組相比，CL-A多糖高、中、低劑量組ALT、BUN、CRE水平均顯著降低(P<0.01)，說明CL-A多糖對荷瘤小鼠的肝臟和腎臟也有保護作用。

腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中，機體免疫機制會受到嚴重損傷。IL-6、IFN-γ和TNF-α等血清因子與腫瘤的生長息息相關(guān)。IL-6是一種多效能細胞因子[17]，在腫瘤微環(huán)境模式中，IL-6被證明能啟動腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)[18]。IFN-γ由T細胞產(chǎn)生，能直接抑制腫瘤細胞增殖，增加表面主要組織相容性復(fù)合體( major histocompatibility complex, MHC)抗原和腫瘤壞死因子的表達，促進抗腫瘤血管生成等[19]。TNF-α是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗癌活性最強的細胞因子，關(guān)于其抗腫瘤機制，目前發(fā)現(xiàn)的主要有誘導(dǎo)凋亡、干擾腫瘤血管系統(tǒng)和增強宿主機體免疫力3個方面[20]。且TNF-α與IFN-γ聯(lián)合應(yīng)用時抗腫瘤活性更強，可引起同源性腫瘤消退[21]。本試驗中，同模型組相比，給藥10 d后，CL-A多糖高、中、低3個劑量組可極顯著降低荷瘤小鼠血清中的IL-6水平，極顯著升高IFN-γ和TNF-α水平;CL-A多糖組小鼠血清IFN-γ和TNF-α水平較CTX組均有提高，說明雜色云芝多糖能通過調(diào)節(jié)IFN-γ和TNF-α細胞因子水平而發(fā)揮抗腫瘤作用。

H&E染色結(jié)果表明，CTX組和CL-A多糖組組織均出現(xiàn)一定的壞死區(qū)域，而CTX組壞死區(qū)域較大，CL-A多糖組壞死區(qū)域較小。同時TUNEL結(jié)果表明，CTX組和CL-A多糖組存在不同數(shù)量的凋亡細胞，且CTX組較CL-A多糖多。結(jié)合H&E染色和TUNEL結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺與CL-A多糖可以通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而抑制腫瘤細胞的生長，但其機理需進一步探究。

綜上所述，CL-A多糖具有一定的抗腫瘤活性，其作用機制可能與免疫調(diào)節(jié)、促腫瘤細胞凋亡有關(guān)，但是否存在其他途徑和通道須進一步深入研究。

[1] 吳興亮,卯曉蘭,圖力古爾.中國藥用真菌 [M].北京：科學(xué)出版社,2013:695-726.

Wu X L,Mao X L,Bau T.Medicinal fungi of China [M].Beijing:Science Press,2013:695-726.

[2] 趙新湖,包海鷹.青芝的本草考證 [J].菌物研究, 2015(1):59-62.

Zhao X H,Bao H Y.Textural research of Qingzhi [J].Journal of Fungal Research,2015(1):59-62.

[3] 梁語絲,鄒華偉,譚永剛.云芝多糖的抗腫瘤作用研究進展 [J].中國實用醫(yī)藥,2014(13):259-262.

Liang Y S,Zou H W,Tan Y G.Study advance of anti-tumor activity ofCoriolusversicolorpolysaccharide [J].China Practical Medicine,2014(13):259-262.

[4] 張立顯,李亞玲,鄧維秀,等.口服云芝多糖對小鼠免疫器官影響的結(jié)果及意義 [J].中國民族民間醫(yī)藥,2010,19(15):88.

Zhang L X,Li Y L,Deng W X,et al.Effects ofCoriolusversicolorpolysaccharide on immune organs in mice with oral administration [J].Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy,2010,19(15):88.

[5] 王菲菲,郝利民,王宗臻,等.云芝總發(fā)酵物及其多糖抗氧化活性比較研究 [J].食品工業(yè)科技,2013,34(13):109-112.

Wang F F,Hao L M,Wang Z Z,et al.Comparison of antioxidation activities of the fermentation products ofCoriolusversicolorand its polysaccharide [J].Technology of Food Industry,2013,34(13):109-112.

[6] 南鳳仙,邵 偉.云芝多糖對小鼠抗衰老作用的研究 [J].寧夏大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,26(3):264-267.

Nan F X,Shao W.Study on anti-aging effect ofCoriolusversicolorpolysaccharide [J].Journal of Ningxia University(Natural Science Edition),2005,26(3):264-267.

[7] 鐘 萍,王云甫,李 萍.云芝多糖對小鼠免疫性肝損傷保護作用及機制的研究 [J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2011,21(31):3881-3883.

Zhong P,Wang Y F,Li P.Protective action and its mechanism of polysaccharides on immunological liver injury [J].China Journal of Modern Medicine,2011,21(31):3881-3883.

[8] 李玲艷,包海鷹.云芝的化學(xué)成分及藥理活性研究概況 [J].菌物研究,2011,9(3):180-186.

Li L Y,Bao H Y.Summarization of researches on chemical compositions and pharmacological activities ofCoriolusversicolor[J].Journal of Fungal Research,2011,9(3):180-186.

[9] 婁 寧,陳 瑗,周 玫,等.云芝多糖對實驗性動脈粥樣硬化家兔的治療作用 [J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1995(3):185-187.

Lou N,Chen Y,Zhou M,et al.Therapeutic effect of polysaccharide fromCoriolusversicoloron experimental atherosclerotic rabbits [J].Journal of Southern Medical University,1995 (3):185-187.

[10] 焦連慶,于 敏,劉 輝,等.樹舌多糖中中性糖及糖醛酸的含量測定 [J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2005,23(9):1583-1584.

Jiao L Q,Yu M,Liu H,et al.Determination of neutral saccharide and uronic acid in polysaccharides ofGanodermaapplanatum[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,2005,23(9):1583-1584.

[11] 王艾平,周麗明.考馬斯亮藍法測定茶籽多糖中蛋白質(zhì)含量條件的優(yōu)化 [J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,43(3):150-153.

Wang A P,Zhou L M.Determination of protein content inCamelliaoleiferaseed polysaccharides by coomassie brilliant blue method [J].Journal of Henan Agricultural Sciences,2014,43(3):150-153.

[12] 魏江春.菌物生物多樣性及其資源研發(fā)前景：獻給《菌物研究》創(chuàng)刊10周年 [J].菌物研究,2012,10(3):125-129.

Wei J C.Fungal biodiversity resources and development prospects for 10 anniversaries of Journal of Fungal Research [J].Journal of Fungal Research,2012,10(3):125-129.

[13] 張靜潮,李榮春.中國藥用真菌研究概述 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(18):6118-6120.

Zhang J C,Li R C.Overview of Chinese medicinal fungi research [J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2014,42(18):6118-6120.

[14] 張云波.環(huán)磷酰胺對免疫系統(tǒng)的影響 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,20(30):12040-12042.

Zhang Y B.Effect of cyclophosphamide on immune system [J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2013,20(30):12040-12042.

[15] 何雅馨.環(huán)磷酰胺對小鼠脾臟的病理學(xué)影響 [D].四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

He Y X.The pathological effects of cyclophosphamide on spleen in mice [D].Ya’an，Sichuan：Sichuan Agricultural University,2015.

[16] 胡 東.環(huán)磷酰胺對小鼠胸腺病理學(xué)影響的研究 [D].四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

Hu D.The pathological effects of cyclophosphamide on thymus in mice [D].Ya’an，Sichuan：Sichuan Agricultural University,2015.

[17] Hirano T.Revisiting the 1986 molecular cloning of interleukin 6 [J].Front Immunol,2014,23(5):456-458.

[18] Sansone P,Bromberg J.Targeting the interleukin-6/Jak/STAT pathway in human malignancies [J].J Clin Oncol,2012,30(9):1005-1014.

[19] 盧 琳,王占聚,崔為發(fā).IFN-γ與腫瘤免疫逃避的研究進展 [J].臨床與病理雜志,2004,24(5):419-422.

Lu L,Wang Z J,Cui W F.Advances in IFN-γ and tumor immune evasion [J].Journal of Clinical and Pathological Research,2004,24(5):419-422.

[20] 向春艷,何小燕,李逐波,等.TNF-α在癌癥中的作用研究進展 [J].生命科學(xué),2012(3):250-254.

Xiang C Y,He X Y,Li Z B,et al.Recent advance in the role of TNF-α in cancer [J].Chinese Bulletin of Life Sciences,2012(3):250-254.

[21] 金 玲,劉菊妍,孫升云,等.靈芝孢子油軟膠囊對H22肝癌小鼠抑瘤作用及免疫功能的影響 [J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(4):715-718.

Jin L,Liu J Y,Sun S Y,et al.Antitumor and immunoregulation effects of Ganoderma spore oil soft capsule on mice of hepatocarcinoma H22cells-derived tumor [J].China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,2011,26(4):715-718.