鎘脅迫對3個棉花品種生理生化特征及農(nóng)藝性狀的影響

陳浩東 ，賀云新 ，郭利雙，趙瑞元，李玉軍，吳佶膛，彭世杰，張志剛

（湖南省棉花科學研究所/國家雜交棉研究推廣中心，湖南常德415101）

土壤中的重金屬污染物主要包括：鎘（Cd）、汞 （Hg）、 鉛 （Pb）、 銅 （Cu）、 鉻 （Cr）、 鎳 （Ni）、 銀（Ag）、鉛（Pb）及其化合物等，其中鎘污染最為嚴重。調(diào)查發(fā)現(xiàn)鎘的污染主要來自于工業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、城鎮(zhèn)建設(shè)及“三廢”排放[1]。當前，我國重金屬污染農(nóng)田的面積已經(jīng)達到1.4×107hm2，同時由于鎘污水的灌溉對11個省市25個地區(qū)近6.3×107hm2的農(nóng)田造成不同程度的污染，每年生產(chǎn)的鎘大米多達5.0×104t，對國民的健康造成極大的威脅[2]。在國內(nèi)，湖南省是典型的鎘污染地區(qū)之一，其中長沙、株洲、湘潭、衡陽等地的鎘污染較為嚴重。20世紀90年代，對湖南省區(qū)域內(nèi)的農(nóng)田污染情況進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)：工廠和礦山排放的廢氣和廢水是農(nóng)田鎘污染的主要來源，鎘污染導致5%～10%的農(nóng)田發(fā)生明顯的減產(chǎn)現(xiàn)象[3]。近些年，息朝莊等[4]對長沙市多個區(qū)域內(nèi)的土壤重金屬污染調(diào)查結(jié)果顯示，長沙全市單項鎘污染指數(shù)已經(jīng)達到79.9，屬于重度污染；雷鳴等[5]對湖南省冶煉區(qū)和采礦區(qū)水稻重金屬污染情況以及其潛在風險的調(diào)查研究也證實湖南省各地區(qū)都存在較為嚴重的鎘污染。在湖南地區(qū)大力開展鎘污染耕地的治理及修復工作刻不容緩。

對于鎘污染的治理和修復方法目前有3種，分別是物理修復、化學修復、生物修復，但最富有成效的是生物修復。目前世界各國都在積極尋找和培育鎘耐受性及累積能力好的物種進行鎘污染土壤的修復。在微生物方面，劉紅娟等[6]發(fā)現(xiàn)，蠟狀芽孢桿菌RC菌種具有優(yōu)異的鎘耐受性，可以在鎘質(zhì)量濃度為200 mg·L－1的固體培養(yǎng)基上正常生長；夏彬彬等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)芽孢桿菌擁有很好的耐鎘性，其最大耐鎘質(zhì)量濃度在100 mg·L－1左右。 Ziagova 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌表現(xiàn)出優(yōu)異的鎘吸收和積累能力，最大吸附量高達278 mg·g－1。 Fomina 等[9]證實真菌也具有良好的重金屬吸附能力，其多孔結(jié)構(gòu)的細胞壁使其活性化學配位體容易與金屬離子結(jié)合，同時真菌的胞壁多糖可提供氨基、羧基、羥基、醛基及硫酸根等官能團，因而可以同時通過螯合和絡(luò)合作用吸附重金屬[10]。在植物鎘污染修復研究方面，目前已發(fā)現(xiàn)超過400種植物具有優(yōu)良的鎘吸附和累積能力。植物修復就是利用某些植物鎘積累能力強的特性來清除土壤中的鎘污染，達到凈化效果。其中印度芥菜的鎘耐受值高達200 mg·kg－1[11]。劉云國等的研究顯示，月季花在正常生長發(fā)育情況下平均每天吸收鎘的含量達到1.757 6 mg·L－1[12]。美人蕉在高濃度鎘土壤（5 mg·kg－1）中的生長發(fā)育也幾乎不受影響并可以吸附大量的鎘[13]。因此植物修復實施比較簡便、投資較少、修復效果好且對環(huán)境破壞較輕，能大規(guī)模推廣，是目前最理想的污染土壤治理修復方法。

雖然已發(fā)現(xiàn)的具有較好吸附和累積鎘的植物有超過400種，但還沒有發(fā)現(xiàn)具有較好的鎘吸附和累積能力且可以推廣應(yīng)用的作物。目前的研究發(fā)現(xiàn)，鎘污染區(qū)的棉花在其主要產(chǎn)物纖維和棉籽中鎘的吸附和累積量很低，因此棉花是作為鎘污染修復作物的潛在對象，可能應(yīng)用于鎘污染耕地的修復。本研究選取了適宜本地區(qū)種植的3個棉花品種(含雜交種、品系，下同)，對這3個品種的鎘耐受性和吸附累積能力進行研究，以期為棉花作為替代種植作物對鎘污染耕地的修復應(yīng)用和推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試棉花品種：C184、湘雜棉15號和湘419（2015年參加區(qū)試時更名為湘FZ010）3個棉花品種，其中C184和湘419為常規(guī)種，湘雜棉15號為雜交種，均由湖南省棉花科學研究所提供。CdCl2·2.5H2O晶體購自上海生工公司，棉花栽培專用基質(zhì)購自常德市科農(nóng)物資有限公司。雙抗體夾心試劑盒購自天根試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 鎘脅迫處理的設(shè)置。鎘脅迫處理棉花采用盆栽方式種植，設(shè)置4個鎘質(zhì)量濃度：0 mg·L－1（空白對照）、1.0 mg·L－1、5.0 mg·L－1和 10.0 mg·L－1，3個不同棉花品種，總共12個處理（表 1所示）。出苗后，每盆定苗1株為1個重復，每個處理設(shè)置20個重復。定期澆水，保持基質(zhì)濕度，無雨天搬出室外，避免溫室溫度過高，其他栽培管理方法與大田栽培相同。

1.2.2 鎘脅迫相關(guān)測定樣品的選取和處理。分別在苗期、蕾期、花鈴期和吐絮期對各個處理的葉片進行取樣，在上午9時左右采取完全隨機方式對每個處理植株的主莖倒數(shù)第3、4片葉進行取樣，樣品用冰盒保存運送至實驗室。每處理稱取葉片樣本4 g用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后在溫度?～8℃時，加入一定量的磷酸緩沖液，對樣品進行充分研磨，收集勻漿液至20 m L離心管，加入磷酸緩沖液定容至20 m L，2.0×104r·m in－1離心20 m in，仔細收集上清液，分開裝存，一部分待檢測，其余部分冷凍備用。

采用完全隨機的方式對每個處理的棉花植株進行整株取樣，然后將其分成根、莖和葉3部分或4部分（吐絮期需要分成根、莖、葉和鈴絮4部分），根部用自來水沖洗后再用蒸餾水漂洗。將樣品置120℃烘箱中殺青1 h，隨后調(diào)整烘箱溫度至80℃，在烘箱中將樣品進行干燥直至恒重。烘干后各樣品干物質(zhì)用牛皮紙袋封存，保存于干燥環(huán)境，每個樣品取3次重復。

表1 試驗處理編號Table 1 Treatment numbers

表2 標準管酶含量Table 2 Enzyme content of the standard tube

1.2.3 棉花農(nóng)藝性狀的測定。在棉花吐絮期使用測量尺對各處理植株地上部分的高度進行測量和統(tǒng)計。

1.2.4 抗氧化酶活性測定及MDA含量測定方法。采用酶聯(lián)免疫分析 （Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法，利用雙抗體夾心試劑盒測定功能葉片的SOD （Superoxide dismutase）、POD（Peroxidase）和 CAT（Catalase）的酶活性以及 MDA（Malondialdehyde）含量，具體實驗步驟如下：首先，用純化的植物酶抗體包被試劑盒上的微孔板，制成固相抗體；再往包被單抗的微孔中加入植物酶抗原，然后與被HRP（Horseradish peroxidase）標記的酶抗體相結(jié)合，從而形成抗體-抗原-酶標抗體的復合物；最后經(jīng)過徹底洗滌后加入底物TMB（Tetra methyl benzidine）進行顯色反應(yīng)。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)變成藍色，最后在酸的作用下最終變?yōu)辄S色。顯色后顏色的深淺與樣品中的酶活性或者含量呈正相關(guān)關(guān)系。再把樣品放入用酶標儀中，調(diào)整波長為450 nm，測定樣品的吸光度（OD值），通過標準曲線計算出樣品中的酶活性或者含量。

標準品的稀釋方法：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10個，在第1、2個孔中需要加標準品100 μL，然后分別在第1、2孔中加標準品稀釋液50 μL，混勻；然后從第 1、2 孔中各取 100 μL 分別加到第3、4孔，再在第3、4孔分別加標準品稀釋液50 μL，混勻；然后在第 3、4 孔中先各取 50 μL 棄掉，再各取50 μL分別加到第5、6孔中，再在第5、6孔中分別加標準品稀釋液 50 μL，混勻；混勻后從第 5、6孔中各取 50 μL分別加到第 7、8孔中，再在第7、8孔中分別加標準品稀釋液50 μL，混勻后從第7、8孔中分別取50 μL加到第 9、10中，再在第9、10孔分別加標準品稀釋液50 μL，混勻后從第9、10孔中各取50 μL棄掉，稀釋后各孔加樣量均為50 μL。標準管的最終濃度如表2。

1.2.5 鎘含量測定。（1）研磨：將烘干后的各個器官分別粉碎，過120目篩篩選。

（2）消化：稱取0.500 00 g粉狀樣品，置于150 m L錐形瓶中，放入數(shù)粒玻璃珠，然后加入HNO3和 HClO4的混合酸 （HNO3:HClO44:1）10 m L，浸泡過夜后，加一定量到電爐上加熱消解，消解溫度為230℃，消化完成的標志是白色煙基本消失，消化液呈無色透明或者淺黃色。

（3）定容：將殘渣過濾，溶液移至50 m L容量瓶中。同時做空白對照1份。

（4）測定：測定采用的儀器是石墨爐分光光度計，將消化完成的樣液注入原子吸收分光光度計石墨爐中，電熱原子化后，記錄228.8 nm處的吸光值，其吸光值在一定濃度范圍內(nèi)與鎘含量成正比。

（5）計算：繪制標準曲線，進行結(jié)果計算。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析。采用SPSS V18.0和Microsoft Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

圖2鎘脅迫下3個棉花品種不同生育時期棉株葉片SOD活性分析比對Fig.2 The analysis of SOD activity in leaves of three cotton cultivars treated with different Cd levels at different grow th stages

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘對棉花葉片抗氧化酶活性及MDA累積的影響

2.1.1 鎘對SOD的活性影響。超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于生物體中的抗氧化物酶類，參與了諸多環(huán)境脅迫的生理應(yīng)答過程，其活性的變化是衡量植物體清除活性氧能力的重要標志。就總體趨勢而言，隨著生育進程的進行，葉片SOD酶活性呈上升趨勢，這一趨勢與鎘濃度大小無關(guān)。數(shù)據(jù)分析顯示（圖1）：3個棉花品種間鎘對葉片SOD活性的影響差異體現(xiàn)在苗期和蕾期：在苗期，湘雜棉15葉片中SOD活性顯著高于其他2個常規(guī)棉品種。在花鈴期和吐絮期低濃度鎘（1 mg·L－1）與高濃度鎘脅迫（5 mg·L－1和 10 mg·L－1）對SOD的活性影響呈現(xiàn)出顯著差異，高濃度鎘脅迫顯著抑制SOD的活性。同時不同鎘濃度對SOD活性影響的比對分析發(fā)現(xiàn)：5 mg·L－1為鎘對全生育期葉片SOD活性影響的閾值。另外，苗期和蕾期低濃度鎘（1 mg·L－1）導致棉花 SOD活性出現(xiàn)小幅度的上升，這說明低濃度鎘脅迫有助于激活棉花細胞體中抗氧化酶的活性。

2.1.2 鎘對POD的活性影響。過氧化物酶（POD）參與催化多種還原劑的氧化反應(yīng)，是植物細胞內(nèi)的重要保護酶，與植物的抗逆能力密切相關(guān)。鎘對3個棉花品種全生育期葉片POD活性影響分析顯示（圖3）：鎘對棉花葉片POD活性有明顯的抑制作用，3個棉花品種間鎘對葉片POD活性的影響趨勢并無顯著的差異。高濃度鎘（5 mg·L－1和 10 mg·L－1） 脅迫下 POD 活性遠低于低濃度鎘（0 mg·L－1和 1 mg·L－1）脅迫下的活性。在花鈴期和吐絮期，在0～5 mg·L－1的鎘脅迫濃度區(qū)間，鎘對POD活性的抑制作用與基質(zhì)中的鎘濃度呈線性關(guān)系；當濃度達到5 mg·L－1后，POD活性下降幅度變小，鎘對葉片POD活性的影響達到最大臨界值。這說明鎘脅迫與棉花葉片POD活性有顯著的相關(guān)性，鎘抑制POD的活性，導致棉花細胞內(nèi)活性氧（ROS）的累積，抑制棉花的生長，特別是生殖生長過程。

2.1.3 鎘對CAT活性的影響。過氧化氫酶（CAT）是植物體過氧化物酶體中的標志酶，也是清除植物細胞內(nèi)活性氧的重要抗氧化酶，其活性影響著植物的抗逆能力。棉花不同生育期葉片CAT活性對比發(fā)現(xiàn)CAT的活性隨著生育進程的進行呈緩慢上升趨勢，但鎘脅迫處理后不同時期葉片的CAT活性沒有出現(xiàn)明顯的變化規(guī)律。不同濃度鎘脅迫處理間對棉花葉片CAT活性影響也沒有顯著性差異。說明鎘脅迫對葉片CAT的活性沒有明顯的影響（圖4）。

圖3鎘脅迫下3個棉花品種不同生育時期棉株葉片POD活性分析比對Fig.3 The analysis of POD activity in leaves of three cotton cultivars treated with different Cd levels at different grow th stages

2.1.4 鎘對葉片MDA累積的影響。丙二醛（MDA）是生物細胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，是衡量膜脂過氧化程度的重要指標。MDA的產(chǎn)生導致細胞膜受損，使細胞加速氧化衰老。利用ELISA法測定了3個棉花品種在4個鎘濃度脅迫下的各個生育期的葉片MDA含量，發(fā)現(xiàn) （圖5）：就3個棉花品種之間顯現(xiàn)的差異而言，湘雜棉15生殖發(fā)育期葉片MDA含量相對較低，在營養(yǎng)生長時期葉片MDA含量處于3個品種的中間水平；C184品種在苗期葉片MDA水平明顯低于其他2個品種。同時還發(fā)現(xiàn)幼苗期棉花在鎘脅迫下葉片的MDA含量始終維持在正常水平，且不同鎘濃度處理之間差異不顯著；其他3個生育期（蕾期、花鈴期、吐絮期）棉花在高濃度鎘（5 mg·L－1和 10 mg·L－1）處理下葉片的 MDA 含量顯著高于低濃度鎘 （0 mg·L－1和 1 mg·L－1）處理的MDA含量，當濃度達到 5 mg·L－1后，棉花葉片MDA的累積達到最大臨界值，鎘濃度的進一步增加，葉片中MDA含量增加幅度變小，雜交棉品種MDA含量甚至出現(xiàn)下降趨勢。在1～5 mg·L－1鎘濃度區(qū)間，鎘濃度和葉片MDA含量呈正相關(guān)關(guān)系，基質(zhì)中1 mg·L－1左右的鎘濃度有利于葉片細胞內(nèi)MDA的消耗，從而促進植株生長。

圖4鎘脅迫下3個棉花品種不同生育時期棉株葉片細胞CAT活性分析比對Fig.4 The analysis of CAT activity in leaves of three cotton cultivars treated with different Cd levels at different grow th stages

圖5鎘脅迫下3個棉花品種不同生育時期棉株葉片細胞MDA含量比較Fig.5 The analysis of MDA content in leaves of three cotton cultivars treated with different Cd levels at different grow th stages

圖6不同處理鎘濃度脅迫下棉花的株高Fig.6 Plant height of treated with different Cd levels

2.2 鎘對棉花株高的影響

在棉花吐絮期對棉花的株高進行測量和統(tǒng)計，結(jié)果顯示（圖6），12個實驗組棉花植株的平均株高在84.0～103.8 cm之間，不同實驗組之間存在較大差異。同一棉花品種在不同鎘濃度處理下，在1 mg·L－1的鎘處理實驗組的平均棉株高度最高，在高濃度（5 mg·L－1和 10 mg·L－1）的鎘脅迫下，棉株的平均高度顯著低于鎘對照組。在相同鎘濃度的處理中，雜交棉湘雜棉15號的株高均要高于其他兩個常規(guī)棉品種的植株高度，表現(xiàn)出更為優(yōu)異的耐鎘能力，C184次之。當鎘處理濃度為1 mg·L－1時，湘雜棉15號株高的增長幅度為6.6%，顯著高于C184的3.5%和湘419的2.4%的增幅。當鎘處理濃度為5 mg·L－1時，湘雜棉15號的株高下降幅度為0.4%，低于C184的3.5%和湘419的8.3%；當鎘處理濃度為10 mg·L－1時，湘雜棉株高的下降幅度為6.0%，低于C184的9.5%，高于湘419的2.0%。

2.3 棉花對鎘富集作用

整體來說，葉片的鎘含量高于莖部和根部，而莖部的鎘含量高于根部；當基質(zhì)中的鎘濃度增加，根、莖和葉的鎘含量也隨之升高。

分品種看，當基質(zhì)中鎘濃度為1 mg·L－1時，湘雜棉15號和C184的根部、莖部和葉片的鎘含量都比較高，湘419各器官中的鎘含量都比較低。當基質(zhì)中鎘濃度達到5 mg·L－1的時候，根部和葉片鎘含量最高的品種是湘419，湘雜棉15號的鎘含量次之；湘雜棉15號莖部鎘含量最高。當基質(zhì)中鎘濃度達到10 mg·L－1的時候，湘419根部和莖部鎘含量較高，而其他2個品種的鎘含量相當；湘雜棉15號葉片中的鎘含量是3個品種中最高的，達到2.066 mg，大約為C184和湘419的 2 倍（表 3）。

為了評估棉花對鎘的富集能力，實驗通過對不同鎘濃度生長條件下棉株中鎘含量進行了測定。數(shù)據(jù)分析顯示（表3）：普通基質(zhì)存在一定濃度的鎘，對照組中的棉株中也有少量鎘富集；額外施加鎘處理導致棉株中鎘含量出現(xiàn)明顯上升，且與土壤中的鎘濃度呈正相關(guān)。其中雜交棉湘雜棉15號在10 mg·L－1的鎘處理下單株棉較其他2個品種富集了更多的鎘，單株鎘的富集含量達到了3 mg，表現(xiàn)出優(yōu)異的鎘富集能力和鎘耐受性；其次是湘419品種也顯現(xiàn)出較為優(yōu)異的鎘富集能力，5 mg·L－1鎘濃度處理下單株棉花富集了鎘1.7 mg。

3 討論

本研究以C184、湘雜棉15號和湘419這3個湖南本地棉花品種為研究材料，從農(nóng)藝性狀、保護酶系統(tǒng)和鎘的耐受性及積累能力等多方位探究了不同棉花品種對鎘的耐性和吸附能力。鎘由根部細胞吸收至植物體內(nèi)，形成鎘逆境，產(chǎn)生大量的超氧陰離子，使得SOD、POD和CAT活性降低，而MDA大量積累，從而對細胞產(chǎn)生毒害作用。鎘在植物體內(nèi)長期存在，長時間的毒害作用直接影響植株的生長發(fā)育，進而影響棉花的產(chǎn)量與品質(zhì)[14-15]。然而，隨著鎘脅迫濃度的上升，3個棉花品種苗期葉片中抗氧化酶SOD、POD、CAT活性都沒有出現(xiàn)顯著降低，同時葉片中MDA的含量也沒有顯著增加，這說明棉花幼苗具有非常優(yōu)異的鎘耐受性，鎘對棉花幼苗的生長發(fā)育影響有限。其他生育期低濃度鎘使棉花葉片中的抗氧化酶活性出現(xiàn)不同程度的提高，在一定程度上促進了棉花的生長，導致其株高明顯高于對照組，Liu的相關(guān)研究也印證了這一點[16]。高濃度鎘脅迫對棉花葉片的抗氧化酶活性有顯著的抑制作用，但鎘濃度達到一定的值，鎘對其抗氧化酶的活性及MDA的累積都達到臨界值。這意味著棉花植株成也具有較強的鎘耐受性，棉花可以忍受鎘的長期毒害，且不會導致棉花大幅度的減產(chǎn)。就3個品種之間的差異而言，雜交種湘雜棉15號的鎘耐受性更強，其SOD活性高于其他常規(guī)棉，在高濃度鎘脅迫下葉片中MDA的累積提升幅度小于其他二者，且湘雜棉15號的農(nóng)藝性狀優(yōu)于其他2個品種，所以雜交棉湘雜棉15號更適宜作為耕地鎘修復棉花品種應(yīng)用和推廣。

表3成熟棉株各部分鎘含量Table 3 The Cd content of the mature plant

不同鎘濃度處理下，棉花不同生育期的各器官中鎘含量差異較大，具體表現(xiàn)為，隨著基質(zhì)中鎘濃度的增加，各器官的鎘含量上升。3個品種在4個不同鎘濃度處理下，各生育期不同器官的鎘含量變化趨勢呈現(xiàn)一定規(guī)律：隨生育進程，根部鎘含量呈下降趨勢，莖部的鎘含量則先下降后上升，葉片的鎘含量先下降后上升再下降。同時，不同品種棉花修復鎘污染土壤的能力也有差異：當土壤中鎘濃度為1 mg·L－1左右時，用來進行耕地鎘污染修復的最佳棉花品種是湘雜棉15號，1 mg·L－1的鎘處理下其鎘富集能力最強，每株可以從土壤中吸收0.4 mg左右的鎘元素；當土壤中鎘濃度為5 mg·L－1左右時，湘419的鎘富集量相對較多，每株可以從土壤中吸受1.7 mg左右鎘元素；當土壤中鎘濃度為10 mg·L－1左右時，湘雜棉15號每株棉花可以吸收多達3.0 mg的鎘元素。因此，我們可以根據(jù)土壤鎘污染的程度選擇種植不同棉花品種，從而達到土壤鎘污染修復最佳效果。

4 結(jié)論與展望

目前鎘污染現(xiàn)象日趨嚴重，它不僅不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，還破壞生態(tài)系統(tǒng)，尤其是耕地鎘污染對人類的健康危害極大。棉花作為我國重要的經(jīng)濟作物，表現(xiàn)出了較強的鎘耐受和吸附能力，連續(xù)幾年種植棉花（棉稈拔除）使耕地鎘污染顯著減輕。同時試驗表明，棉花的主要產(chǎn)品棉纖維的鎘吸附量極低，并且棉纖維沒有進入人類的食物鏈，因此棉花是目前較為理想的鎘污染修復作物之一。本試驗對本地區(qū)的3個棉花品種的鎘耐受性和吸附能力進行了全面的評估，其中雜交種湘雜棉15表現(xiàn)出相對較好的鎘耐受性和吸附能力，但還需要進一步改良棉花的鎘耐受性和鎘富集能力，選育可以進行大規(guī)模推廣的鎘耐受性和吸附能力優(yōu)異的棉花品種。

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