慕薩萊思釀造過程中有機酸含量的變化

◎ 王子坤，賈清華，李雅雯，韓愛芝，黃 英，奚 倩，吳 鑫，侯旭杰

（1.塔里木大學分析測試中心，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；3.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

有機酸在整個葡萄酒的釀造過程起到十分重要的作用，有機酸的存在會改善葡萄酒的口感，但是含量要適中?？偹峥梢宰鳛楹饬科咸丫破焚|(zhì)的一個重要指標，用pH值來表示，酸度值位于2.9～3.9。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，以及西方營養(yǎng)學的進步，研究學者發(fā)現(xiàn)了葡萄酒中更多的特性以及獨特用處。葡萄酒中對人體有益的成分有上百種，包含有機酸類、酚類、維生素類，雖某些成分含量不高，但極易被人體的吸收利用。酒中的有機酸類物質(zhì)，能體現(xiàn)出葡萄原料的特征以及成品酒的風味特點，也可以反映釀造工藝的特點。酒石酸又被稱為葡萄酸，化學名稱2,3-羥基丁二酸，成品酒中葡萄酸的含量為1.5～2.5 g·L-1，作為酒中含量比較高的一種酸，會對酒的顏色產(chǎn)生一定影響[1-4]。自然界水果中都存在蘋果酸，隨著酒釀造過程進行，酒精發(fā)酵結(jié)束后便會進入蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段。蘋乳發(fā)酵降低了生酒的生青味和酸澀度、粗糙度和色度等，使酒體更加柔和、圓潤。乳酸產(chǎn)生于葡萄酒發(fā)酵第二階段，它的濃度直接影響著pH值，在人體中也產(chǎn)生乳酸，但是濃度不會上升的太高。丙酮酸是一種重要的中間代謝產(chǎn)物，在糖酵解發(fā)生時磷酸烯醇丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下生成丙酮酸，對葡萄酒的口感影響較低，因為在發(fā)酵過程被分解所以含量低。在植物動物體內(nèi)都有草酸的存在。植物中的草酸多以草酸鈣而存在，在成品酒中幾乎沒有，對口感沒有很大影響。甲酸酸性很強，可以刺激皮膚。乙酸、乙醇可以形成香味物質(zhì)乙酸乙酯，如果發(fā)酵后期沒有很好的隔絕空氣，或者有可能被雜菌感染，乙酸濃度增大，說明酒已經(jīng)變質(zhì)。琥珀酸又叫丁二酸，在酵母發(fā)酵的過程中，經(jīng)三羧酸循環(huán)均會代謝產(chǎn)生琥珀酸；蘋乳發(fā)酵形成琥珀酸；谷氨酸的轉(zhuǎn)化也形成琥珀酸[5-9]。葡萄果實中均含有檸檬酸。在TCA循環(huán)中檸檬酸僅是中間產(chǎn)物。

1 試驗材料

1.1 材料與試劑

實驗室自釀慕薩萊思在A（原汁）、B（濃縮）、C（陳釀）三個階段進行采樣，成品酒（D）來自新疆阿瓦提刀郎慕薩萊思有限公司，阿瓦提慕薩萊思（葡萄）。

標準品：草酸、DL-酒石酸、甲酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、一水檸檬酸、D-蘋果酸、琥珀酸（Dr.Ehrenstorfer GmbH）。 丙 酮 酸 [Alfa Aesar（China）Chemicals Co. Ltd]，抗壞血酸（天津市風船化學試劑），十三烷酸甲酯（上海安譜）。標準品純度均在99%以上。

1.2 儀器設備

WATERS 2695高效液相色譜儀（美國Waters儀器公司），GL-20 G-2高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠），BP211D電子分析天平（北京賽多利思有限公司），SB-25-12DT超聲波清洗機（寧波新芝生物公司），100～1 000 μL微量移液槍（上海安譜），Trace1300 ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo公司），DB-5MS UI（30×0.250×0.25）氣相色譜柱（美國Agilent公司），N-1100-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、CCA-1111冷卻水循環(huán)裝置、DC-12H恒溫水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）。

1.3 試驗方法[10-11]

1.3.1 定性分析

使用氣質(zhì)聯(lián)用儀自帶的譜庫進行檢索，分析結(jié)果，參考文獻、查詢相關資料共同進行定性。

（1）氣相色譜條件。DB-Wax毛細管柱（30 mm×0.25 μm）；載氣He（99.999%）；恒流，柱流速1.0 mL·min-1；分流比25∶1；進樣量2.0 μL；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初溫40 ℃，保持2 min，以7 ℃·min-1升至 150 ℃，保持 5 min，再以 6 ℃·min-1升至250 ℃，保持5 min。

（2）質(zhì)譜條件。電子電離源：電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；傳輸管線溫度280 ℃；溶劑延遲時間3.5 min；掃描模式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 29～500。

1.3.2 試劑準備

利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將甲醇中的水分蒸干，溫度40 ℃，制成無水甲醇，將50 mL濃硫酸加入到350 mL的無水甲醇中，加入的同時冷水浴，并使用玻璃棒不斷攪拌。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將二氯甲烷中的水分蒸干，溫度35 ℃，制成無水CH2Cl2。

在標準天平室稱取標準品，稱取0.025 g十三烷酸甲酯，用甲醇溶解標準品，并用膠頭滴管定容至25 mL，得到1 mg·mL-1內(nèi)標標準儲備液，放于冰箱4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品前處理

取約40 g樣品加入250 mL三角瓶，加入1 mg·mL-1十三烷酸甲酯內(nèi)標儲備液500 μL，再加入60 mL 12.5%的硫酸-甲醇溶液，搖勻后放入于35 ℃培養(yǎng)箱，130 r·min-1，恒溫30 h。拿出反應液然后倒入漏斗過濾，過濾完成后使用重蒸好的二氯甲烷60 mL進行萃取，萃取完成加入飽和氯化鈉洗滌2次，洗滌完成加入10 g無水硫酸鈉，除去水分，然后密封置于-20 ℃冰箱靜置過夜。除去干燥劑后用高純度氮氣吹掃，濃縮，液體轉(zhuǎn)移到5 mL容量瓶中，用重新蒸餾過的二氯甲烷溶液定容，取定容溶液2.0 μL進行GC-MS分析。

1.3.4 有機酸的HPLC定量分析

（1）標準溶液。稱取酒石酸、蘋果酸、一水檸檬酸、抗壞血酸、琥珀酸、草酸各0.05 g，用超濾水定容至5 mL；甲酸、乙酸、乳酸、丙酮酸各20 μL，定容至2 mL，濃度分別為10 mg·mL-1，此液為標準儲備液。

（2）標準使用液。分別取標準使用液0.02、0.1、0.2、0.5 mL和1.0 mL，加入0.2 mL的1 mol·L-1的磷酸，用超濾水稀釋至10 mL，混勻。樣品上機體積10 μL，在210 nm位置處測量峰高或峰面積，有機酸的濃度大小作為橫坐標，相應的色譜峰的峰面積作為縱坐標，并且使用軟件做出標準曲線，得出回歸方程。

1.3.5 樣液的制備

將放在冰箱的樣品進行解凍，取15～20 mL的樣品倒入離心管，設定離心機10 000 r·min-1時間5 min，拿出離心管得到上清液5 mL，小心轉(zhuǎn)入準備好的10 mL容量瓶，加入配制好的0.2 mL的磷酸溶液（1 mol·L-1），稀釋至10 mL使用超純水，濾膜使用0.45 μm過濾，得到濾液以便供分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS定性實驗數(shù)據(jù)

樣品經(jīng)過甲酯化衍生以后，二氯甲烷作為溶劑而后進行萃取，萃取液經(jīng)過濃縮，然后用GC-MS儀器進行定性分析，得到GC-MS總離子流圖，據(jù)質(zhì)譜總離子流圖，同時通過儀器自帶的數(shù)據(jù)庫，進行檢索，也可以人工手動解析，從而對目標峰進行定性，確定有機酸的種類。樣品中各個有機酸的種類、保留時間及相似度見表1，各階段GC-MS圖譜如圖1～3所示。

表1 樣品中各個有機酸的種類、保留時間及相似度表

圖1 原汁階段GC-MS圖譜圖

圖2 濃縮階段GC-MS圖譜圖

圖3 陳釀階段GC-MS圖譜圖

通過表1可以準確地確定有機酸的種類，進行比較準確的定性，相關系數(shù)都達到了800以上，通過GC-MS進行定性，結(jié)果準確可靠。

2.2 11種有機酸標準曲線的建立

為了更準確的計算樣品中有機酸的含量，本試驗采用外標法對不同時間段樣品中的有機酸進行含量分析。繪制了各有機酸的峰面積-濃度曲線，計算11種有機酸的回歸方程和相關系數(shù)，并給出了其線性范圍，繪制的標準曲線及相關系數(shù)，如表2所示。

表2 11種有機酸的保留時間與線性回歸方程表

11種標準品色譜圖如圖4所示，通過色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，11種標準品可以很好地分離，所采用的色譜條件可以滿足樣品分析需要。

圖4 11種有機酸混標色譜圖

2.3 標準品保留時間的重現(xiàn)性分析

為了驗證方法保留時間的重現(xiàn)性，對11種標準品進行了6次重現(xiàn)性試驗，并計算標準品6次保留時間（min），結(jié)果如表3所示。

表3 標準品混標的重現(xiàn)性實驗結(jié)果表

從表3得知，各種有機酸保留時間相對標準偏差在0.021%～0.598%，說明儀器系統(tǒng)與實驗方法可靠，樣品重現(xiàn)性好，可以滿足樣品分析需要。

2.4 HPLC法對樣品中有機酸含量的分析

樣品中的有機酸含量見表4。

表4 樣品中含有的有機酸含量表

通過前期預實驗可知，當樣品未完全溶解時，樣品中的有機酸的含量會比完全溶解時的含量要多。所以，為得到準確的實驗結(jié)果，需要將樣品完全解凍，分析解凍后的樣品中所含有的有機酸的種類及其含量。薩萊思葡萄酒在濃縮階段，含有DL-酒石酸、D-蘋果酸、L-蘋果酸、一水檸檬酸、琥珀酸。其中酒石酸的含量最大也是最穩(wěn)定的，而丙酮酸與琥珀酸只是在一個時間段檢測出，且含量還比較低，一水檸檬酸在濃縮期含量變大，隨后消失。D-蘋果酸隨著濃縮的時間越長，含量逐漸減小，而L-蘋果酸卻隨著濃縮時間越長，含量逐漸增大，但是D-蘋果酸與L-蘋果酸濃度之和在逐漸增大。在陳釀期時，琥珀酸沒有檢測出來，丙酮酸出現(xiàn)，L-蘋果酸，酒石酸含量降低、D-蘋果酸的含量大致沒有發(fā)生變化。在成品酒慕薩萊思中檢測出了4種有機酸，分別是DL-酒石酸、L-蘋果酸、丙酮酸、琥珀酸。

3 結(jié)論

利用液相色譜儀對濃縮階段葡萄汁、慕薩萊思葡萄酒中有機酸進行了分析，在濃縮葡萄汁階段，含有DL-酒石酸、DL-蘋果酸、一水檸檬酸、琥珀酸。在慕薩萊思葡萄酒中只檢測出了DL-酒石酸、L-蘋果酸、丙酮酸、琥珀酸。定量實驗采用HPLC法、GC-MS法分析慕薩萊思在發(fā)酵及陳釀的不同時期，所含有的有機酸的種類。在實驗階段優(yōu)化條件，條件最終確定為：色譜柱型號CNW Athena C18，（120 A，4.6×250 mm，5 μm），0.01 mol·L-1NaH2PO4（pH=2.7）為流動相條件，0.8 mL·min-1的流速，柱溫設定30 ℃，波長設定210 nm，進樣體積10 μL，可以較好地分離和檢測自釀慕薩萊思葡萄酒在不同時期有機酸含量的變化。所建方法的RSD為0.210%～0.598%，相關系數(shù)R2＞0.999。在GC-MS所分析出的有機酸的種類與HPLC中一部分酸有很大的差異，因為在HPLC中柱子的類型、儀器靈敏度、流動相pH值等都會對結(jié)果產(chǎn)生影響，最主要是因為樣品成分過于復雜導致樣品色譜峰無法很好地分離，所以有機酸種類的確定主要以GC-MS分析結(jié)果為判定依據(jù)，通過圖譜庫確認結(jié)果比較準確，HPLC僅僅通過出峰時間來進行定性是不夠準確的尤其是成分比較復雜的情況下。通過對有機酸的變化進行檢測，通過成分分析，可以對實際生產(chǎn)進行指導，未來可以對其變化機理進行進一步的分析。