蔣奉奇, 袁 瑩, 向祚君, 黃攀蕊, 鄔 赫, 王詩琪, 王 娟 ,彭 暉, 羅 海
(1. 湖南醫(yī)藥學院生理學教研室, 2. 湖南醫(yī)藥學院臨床技能實訓(xùn)中心, 懷化 418000)
葛根素注射液(puerarin injection)是一類藥理作用廣泛的中藥單體注射劑,臨床常用于輔助治療冠心病、心絞痛、心肌梗死、糖尿病及其并發(fā)癥等[1-3]。該藥自1993年上市以來,已有多例引起急性血管內(nèi)溶血的報道,嚴重者可因器官功能衰竭而死亡[4]。目前,葛根素注射液致溶血反應(yīng)的機制仍不明確。文獻報道,葛根素注射液溶血反應(yīng)屬藥源性非免疫性溶血,可能與葛根素影響紅細胞滲透壓、改變紅細胞形態(tài)以及降低紅細胞膜穩(wěn)定性有關(guān)[5-7]。
氯通道在紅細胞膜表面大量表達,可通過影響Cl-、有機滲透物、水等物質(zhì)跨細胞膜轉(zhuǎn)運,影響細胞內(nèi)外滲透壓,進而調(diào)控細胞容積穩(wěn)定[8]。葛根素注射液溶血作用是否與氯通道調(diào)控途徑相關(guān),國內(nèi)外尚無文獻報道。本文旨在探討氯通道在葛根素注射液致溶血反應(yīng)中的作用,為基于離子通道途徑防治葛根素注射液溶血反應(yīng)提供理論依據(jù)。
葛根素注射液(方明藥業(yè)集團,產(chǎn)品批號1511217)內(nèi)含葛根素100 mg/2 ml,作為母液常溫保存。使用時用生理鹽水(NS)稀釋到工作濃度。氯通道阻斷劑他莫昔芬(Tamoxifen,Tam)購自Sigma-Aldrich公司(貨號T5648),用甲醇配制成50 mmol/L儲存液常溫保存,使用時稀釋至20 μmol/L。ATP注射液(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司,產(chǎn)品批號41603228)含三磷酸腺苷二鈉20 mg/ml,做氯通道阻斷劑使用時稀釋成10 mmol/L,做氯通道激動劑使用時稀釋成50 μmol/L,實驗當天配制。
心臟穿刺采集健康日本大耳白兔新鮮全血5 ml,肝素鈉(1000 IU/ml)250 μl抗凝。使用低速離心機(TD5A,長沙湘儀)1 500 r/min離心5 min,吸去血漿層,加入生理鹽水(NS)混勻。再以同樣轉(zhuǎn)速離心,重復(fù) 3 次,直至離心后上清液透亮。去掉上清液,然后取 20 μl壓積紅細胞用NS稀釋至 1 ml混勻,得到2%紅細胞懸液用于實驗。
實驗分組⑴葛根素注射液組:葛根素注射液濃度分別為0.75、1.5、3、6 和12 mg/ml;⑵葛根素注射液 + 氯通道阻斷劑組:3 mg/ml葛根素注射液 + 20 μmol/L Tam組、3 mg/ml葛根素注射液 + 10 mmol/L ATP組;⑶葛根素注射液 + 氯通道激動劑組:3 mg/ml葛根素注射液 + 50 μmol/L ATP;⑷生理鹽水陰性對照組;⑸蒸餾水陽性對照組;⑹藥物自身對照組:20 μmol/L Tam組、10 mmol/L ATP組、50 μmol/L ATP組。每組采集3個以上樣本進行重復(fù)。將上述各組樣品放入37℃恒溫水浴箱(DK-98-Ⅱ,天津泰斯特)孵育6 h。
孵育結(jié)束后,將各組樣品1 500 r/min離心5 min。小心取出上清液,搖勻,按150 μl/孔加入96孔板,每組設(shè)三個平行對照。使用酶標儀(LB942 ,德國Berthold)檢測540 nm吸光度,并按以下公式計算溶血百分率:溶血百分率=(OD 樣品-OD 陰性)/(OD 陽性-OD 陰性) ×100%。其中,OD 陽性表示蒸餾水組完全溶血的OD 值;OD 陰性表示NS組完全未溶血的OD 值;OD 樣品表示樣品某個濃度的OD 值。各組樣本去除上清液后剩余的細胞沉淀,加入NS稀釋至1 ml,取其中500 μl細胞懸液用于流式細胞儀(Cytoflex,美國Beckman)檢測溶血率;另外500 μl細胞懸液置于倒置顯微鏡(NIB-100F,寧波永新)下,使用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0,美國Media Cybernetics)拍攝并觀察紅細胞變化。
本實驗研究了5種不同濃度葛根素注射液對家兔紅細胞的影響。酶標儀檢測結(jié)果顯示(表1),與NS組相比,0.75 mg/ml葛根素注射液組無明顯溶血作用(n=3,P> 0.05);而當葛根素注射液提高至1.5 mg/ml時,溶血率為(7.45±0.71)%,表現(xiàn)出溶血效應(yīng)(n=3,P<0.05);隨著葛根素注射液濃度增加,其溶血作用相應(yīng)增強(n=3,P<0.01),3 mg/ml、6 mg/ml、12 mg/ml時溶血率分別為(17.16±3.32)% 、(33.44±5.40)% 、(57.76±6.62)%。這與樣品直接觀察及細胞圖像系統(tǒng)記錄的結(jié)果一致(圖1)。流式細胞儀檢測結(jié)果與此類似(圖2、表1)。上述結(jié)果均提示,一定濃度的葛根素注射液可誘導(dǎo)紅細胞體外溶血,且作用呈濃度依賴性。
Fig.1The hemolysis induced by puerarin injectioninvitro
Fig.2Flow cytometric analysis of hemolysis induced by different concentration of puerarin injection
A: NS group; B: 0.75 mg/ml puerarin injection group; C: 1.5 mg/ml puerarin injection group; D: 3 mg/ml puerarin injection group; E: 6 mg/ml puerarin injection group; F: 12 mg/ml puerarin injection group
GroupHemolytic percentage (%)Microplate readerFlow cytometryNS0.19±0.030.63±0.410.75 mg/ml puerarin injection0.39±0.060.80±0.341.5 mg/ml puerarin injection7.45±0.71?8.28±0.57?3 mg/ml puerarin injection17.16±3.32??##18.83±1.31??##6 mg/ml puerarin injection 33.44±5.40??ΔΔ34.35±3.45??ΔΔ12 mg/ml puerarin injection57.76±6.62??++56.93±7.28??▲▲
*P<0.05,**P<0.01vsNS group;##P<0.01vs1.5 mg/ml puerarin injection group;ΔΔP<0.01vs3 mg/ml puerarin injection group;▲▲P<0.01vs6 mg/ml puerarin injection group
酶標儀、流式細胞儀檢測結(jié)果顯示(圖3、表2),與3 mg/ml葛根素注射液組溶血率相比,3 mg/ml葛根素注射液 + 20 μmol/L Tam組(n=3)、3 mg/ml葛根素注射液 + 10 mmol/L ATP組(n=5)溶血率均顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。這些結(jié)果提示,用氯通道阻斷劑關(guān)閉氯通道,可部分抑制葛根素注射液誘導(dǎo)的紅細胞溶血。
酶標儀、流式細胞儀分析結(jié)果顯示(圖3、表2),與3 mg/ml葛根素注射液組溶血率相比,3 mg/ml葛根素注射液 + 50 μmol/L ATP組溶血率顯著增強,差異有統(tǒng)計學意義(n=4,P<0.01)。結(jié)果提示,用氯通道激動劑激活氯通道,可增強葛根素注射液誘導(dǎo)的紅細胞溶血。
Fig.3Flow cytometric analysis of hemolysis after treatment with chloride channel blockers and agonists
A: 3 mg/ml puerarin injection group; B: 3 mg/ml puerarin injection+20 μmol/L tamoxifen group; C: 3 mg/ml puerarin injection+10 mmol/L ATP group; D: 3 mg/ml puerarin injection+50 μmol/L ATP group
GroupnHemolytic percentage (%)Microplate readerFlow cytometry3 mg/ml puerarin injec-tion 317.16±3.3218.83±1.313 mg/ml puerarin injec-tion+20 μmol/L Tam 35.17±0.57??6.69±1.04??3 mg/ml puerarin injec-tion+10 mmol/L ATP 52.49±1.00??3.46±1.27??3 mg/ml puerarin injec-tion+50 μmol/L ATP 440.28±7.44??40.57±7.54??
**P<0.01vs3 mg/ml puerarin injection group
為了觀察Tamoxifen、ATP藥物本身是否可引起紅細胞溶血,實驗同時設(shè)置單純相應(yīng)濃度藥物的自身對照組。細胞圖像記錄系統(tǒng)觀測發(fā)現(xiàn)(未顯示),與NS組相比,20 μmol/L Tam組、50 μmol/L ATP組、10 mmol/L ATP組紅細胞數(shù)量和形態(tài)均無明顯改變。酶標儀檢測結(jié)果顯示,20 μmol/L Tam組、50 μmol/L ATP組、10 mmol/L ATP組溶血率分別為(0.26±0.11)%、(0.27±0.16)%、(0.31±0.08)%,均與NS組(0.19±0.03)%溶血率無明顯區(qū)別,差異無統(tǒng)計學意義(n=3,P> 0.05)。結(jié)果提示,實驗中使用的氯通道阻斷劑及激動劑自身對紅細胞無明顯影響,排除了藥物本身誘導(dǎo)紅細胞溶血的可能。
葛根素注射液主要成分為葛根素,是一種從中藥葛根中分離得到的異黃酮類衍生物,其藥理活性較為廣泛,包括血管舒張、心臟保護、神經(jīng)保護、抗氧化、抗炎、抗腫瘤以及減弱胰島素抵抗等。然而,葛根素注射液的急性血管內(nèi)溶血等不良反應(yīng)嚴重影響了其臨床用藥安全。
近來有文獻報道,將膜穩(wěn)定劑牛磺酸與葛根素注射液配伍使用,可一定程度上對抗葛根素注射液引起的紅細胞形態(tài)異常和溶血反應(yīng)[9]。生理狀態(tài)下,?;撬崾遣溉閯游锛毎麅?nèi)與滲透壓調(diào)控密切相關(guān)的重要有機滲透物之一[10,11]。低滲溶液誘導(dǎo)細胞腫脹后,K+、Cl-等無機離子以及?;撬岬扔袡C滲透物可隨之流出,同時伴隨水的被動流出, 調(diào)節(jié)細胞容積,此機制被稱為調(diào)節(jié)性容積減小(regulatory volume decrease,RVD)。我們及其他實驗室的大量研究均證實,RVD過程中,細胞內(nèi)Cl-、?;撬岬热苜|(zhì)外流的主要機制為氯通道的激活[12-15]。那么,?;撬徂卓垢鸶刈⑸湟喝苎磻?yīng)的機制是否和氯通道調(diào)控途徑相關(guān)?氯通道在葛根素注射液致溶血反應(yīng)中有何作用?
本研究首先在體外觀察不同濃度葛根素注射液對家兔紅細胞的作用。文獻報道,葛根素注射液臨床常用輸液濃度約0.8 mg/ml,致溶血時最大輸液濃度約3 mg/ml[16],故本實驗在0.75 mg/ml ~12 mg/ml范圍內(nèi)設(shè)置0.75、1.5、3、6、12 mg/ml共5個劑量。在實驗所觀察的劑量范圍內(nèi),1.5 mg /ml葛根素注射液即可誘發(fā)一定程度的紅細胞溶血,且效應(yīng)隨葛根素注射液濃度增加而增強,表現(xiàn)為濃度依賴性(圖1、圖2、表1)。鑒于我們之前的研究,20 μmol/L Tamoxifen、10 mmol/L ATP可阻斷氯通道,而50 μmol/L ATP有激活氯通道的效應(yīng)[17],在本實驗中我們觀察這些氯通道阻斷劑、激動劑對于臨床致溶血劑量(3 mg/ml)葛根素注射液溶血效應(yīng)的影響。使用氯通道阻斷劑20 μmol/L Tamoxifen、10 mmol/L ATP關(guān)閉氯通道,可部分抑制3 mg/ml葛根素注射液誘導(dǎo)的紅細胞溶血;而使用氯通道激動劑50 μmol/L ATP開放氯通道,則顯著增強3 mg/ml葛根素注射液的溶血效應(yīng)(圖3、表 2)。這些結(jié)果提示,葛根素注射液致溶血作用與氯通道激活密切相關(guān)。實驗中為了觀察Tamoxifen、ATP兩種藥物本身是否可引起紅細胞溶血,還同時設(shè)置了單純相應(yīng)濃度藥物的自身對照組。結(jié)果顯示,20 μmol/L Tamoxifen組、10 mmol/L ATP組、50 μmol/L ATP組與NS組相比紅細胞溶血率無明顯改變,基本排除這些藥物本身誘導(dǎo)紅細胞溶血反應(yīng)的可能。由此我們推測,前述文獻中提及的?;撬崤c葛根素注射液配伍使用,可能通過干預(yù)經(jīng)由氯通道途徑的?;撬峥缒まD(zhuǎn)運過程,進而產(chǎn)生拮抗葛根素注射液溶血反應(yīng)的效果。
綜上所述,本研究結(jié)果表明葛根素注射液可誘導(dǎo)家兔紅細胞體外溶血,作用呈濃度依賴性;氯通道激活與葛根素注射液誘導(dǎo)的溶血反應(yīng)密切相關(guān)。然而,氯通道有囊性纖維跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)體、鈣激活性氯通道、電壓門控氯通道、配體門控氯通道以及容積調(diào)節(jié)性氯通道等多種亞型[18],何種類型的氯通道激活參與葛根素注射液誘導(dǎo)的溶血反應(yīng),其分子機制如何本研究尚未涉及,有待后續(xù)實驗進一步探討。