HPLC法測(cè)定綠咖啡豆提取物中有效成分的含量

邢新鋒　葉強(qiáng)

【摘 要】目的：建立測(cè)定綠咖啡豆提取物中綠原酸的HPLC方法，測(cè)定和比較不同綠咖啡豆提取物綠原酸的含量。方法：采用十八烷基鍵合硅膠填充柱（C18（2），100A，4.6×250mm，5?m）；以乙腈-水-甲酸（250：750：1，v/v/v）為流動(dòng)相A，以乙腈-水-甲酸（100：900：1，v/v/v）為流動(dòng)相B，梯度洗脫為0～20min，0～100%A，100～0%B；20–30min，100%A，0%B；30～32min，100～0%A，0～100%B；32～40min，0%A，100%B，體積流量為1.5mL/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm；進(jìn)樣量10μL。結(jié)果：綠原酸在0.02～0.20μg呈線性良好關(guān)系；其平均回收率（n=18）為99.73%。結(jié)論：該法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可用于綠咖啡豆提取物中綠原酸成分的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】綠咖啡豆提取物；綠原酸

Abstract：Objective To establish an HPLC method for determination chlorogenic acid from Green coffee been extract，determinate and compare the contents of chlorogenic acid from different Green coffee been extract. Methods： The HPLC system consisted of a C18 （4.6×250 mm，5 ?m），the mobile phase A was acetonitrile-water-formic acid（250：750：1，v/v/v），the mobile phase B was acetonitrile-water-formic acid（100：900：1，v/v/v）.The gradient elution condinations： 0～20 min，0～100%A，100～0%B，20 – 30 min，100%A，0%B，30～32 min，100～0%A ，0～100%B，32～40 min，0%A，100%B，The flow rate was 1.5 mL/min and the column temperature was 25 ，The detection wavelength was 330 nm and the injection volume was 10 μl. Results： The calibration curves of chlorogenic acid had good linear relationship in the ranges of 0.02～0.20 μg，And the average recoveries （n=18） of chlorogenic acid was 99.73%，respectively. Conclusion： This method can be applied to determinating the components from Green coffee been extract.

Key words： Green coffee been extract；chlorogenic acid

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1005-0019（2018）23-0-01

綠咖啡豆提取物（Green coffee been extract）是以咖啡樹Coffea arabica L.或羅布斯塔Coffee robusta L.成熟的種子去殼后經(jīng)水或一定比例的乙醇水溶液提取分離制成的植物提取物，其中有效成分主要為綠原酸，具有降壓、抗腫瘤、補(bǔ)腎、抗氧化等作用，也可用作保健食品中，使保健食品香甜可口味道好。目前天然植提行業(yè)中已了解的綠原酸成分有3-咖啡?？崴幔?-CQA）， 5-咖啡?？崴幔?-CQA）， 4-咖啡?？崴幔?-CQA）， 5-阿魏?？崴?， （5-FQA）， 3，4-二咖啡?？崴幔?，4-diCQA）， 3，5-二咖啡酰奎尼酸 （3，5-diCQA）， 和4，5-二咖啡?？崴?（4，5-diCQA）。雖已有不少綠原酸成分的研究，但對(duì)綠原酸含量的測(cè)定卻未見文獻(xiàn)報(bào)道。故本研究建立了HPLC法測(cè)定現(xiàn)在市場(chǎng)中主要的綠咖啡豆提取物中綠原酸的含量的方法，為綠咖啡豆提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-15C高效液相色譜儀；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；PHS-3C型精密pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HWS24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；AE240電子天平（梅特勒-托利多）。UV-1800紫外可見分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）。

1.2 試藥 樣品由浙江天草生物科技有限公司生產(chǎn)提供的樣品（批號(hào)：20161001、20161002、20161003）以及多種市售產(chǎn)品的樣品組成。具體樣品信息見表1。對(duì)照品由浙江天草生物科技有限公司生產(chǎn)提供（批號(hào)：20160801） 含量：98.5%。水為娃哈哈純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司），甲酸（色譜級(jí)），乙腈（色譜級(jí)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用十八烷基鍵合硅膠填充柱（C18（2），100A，4.6250mm，5?m）；以乙腈-水-甲酸（250：750：1，v/v/v）為流動(dòng)相A，以乙腈-水-甲酸（100：900：1，v/v/v）為流動(dòng)相B，按表2中的要求進(jìn)行梯度洗脫；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm；流速為1.5mL/min；進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。

對(duì)照品特征圖譜中呈現(xiàn)7個(gè)特征峰，其中與綠原酸參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。規(guī)定值為：0.66（3-咖啡?？崴?3-CQA），1.00（綠原酸），1.06（4-咖啡?？崴?4-CQA），1.53（5-阿魏?？崴?5-FQA），2.27（3，4-二咖啡?？崴?3，4-diCQA），2.39（3，5-二咖啡?？崴?3，5-diCQA），2.55（4，5-二咖啡酰奎尼酸/4，5-diCQA）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品10mg于10mL量瓶中，加60%甲醇溶液8ml，超聲使溶解，放冷，用60%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取5mL至50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取各樣品25mg，置50mL量瓶中，加60%甲醇溶液40mL，超聲使溶解，放冷，用60%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋，分別精密制成濃度為0.02 mg/mL、0.05mg/mL、0.10 mg/mL、0.15mg/mL和0.20mg/mL的溶液，搖勻，分別精密量取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對(duì)照品的濃度（c）為橫坐標(biāo)，綠原酸面積（A）為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

2.4 定量限和檢測(cè)限 按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，采用對(duì)照品溶液稀釋，進(jìn)樣測(cè)定。分別以3倍和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)的濃度值為測(cè)定方法的檢出限和定量限。結(jié)果見表4。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，根據(jù)主峰峰面積計(jì)算進(jìn)樣精密度，結(jié)果見表5。

進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果說明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品1（批號(hào)20161001）6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定6份樣品的含量，計(jì)算精密度，結(jié)果見表6。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品1（批號(hào)20161001）粗粉適量，在同一實(shí)驗(yàn)室里，在不同的時(shí)間內(nèi)，由不同的實(shí)驗(yàn)者，在不同的儀器上，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，得實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，結(jié)果見表7。

結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定含量的綠咖啡豆提取物樣品1（批號(hào)：20161001）共18份，每份精密稱量，稱量的結(jié)果如下表，配制80%、100%、120%三個(gè)濃度的供試品溶液各六份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，結(jié)果見表8。

2.9 樣品的測(cè)定 取樣品1～10適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1mL中含100μg的溶液，精密量取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取綠原酸對(duì)照品適量，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得，結(jié)果見表9。

測(cè)定結(jié)果顯示目前綠咖啡豆提取物主要產(chǎn)品中綠原酸含量都在20%以上，總綠原酸都在40%以上，可以以此作為綠咖啡豆提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定綠咖啡豆提取物中主要有效成分綠原酸的含量，方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可用于快速測(cè)定綠咖啡豆提取物中綠原酸的含量，為綠咖啡豆提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的科學(xué)參考依據(jù)。