禽流感病毒H7N9亞型三重熒光PCR檢測方法研究

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(鄭州中道生物技術有限公司，河南 鄭州 450000)

0 引言

流感病毒屬于正粘病毒科，基因組是單股、負鏈、多節(jié)段的核糖核酸(RNA)分子。根據流感病毒核蛋白(NP)抗原性差異，可將流感病毒分為A、B、C三型，其中A型流感病毒為最常見的流感病毒，宿主范圍廣泛，可感染大多數哺乳動物、家禽以及野鳥。根據流感病毒表面血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)氨基酸的差異，又可將A型流感病毒分為多個HA亞型和NA亞型。禽流感病毒屬于A型流感病毒，根據致病能力的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和非致病性禽流感。高致病性禽流感傳染性極強，以高發(fā)病率和高致死率為特征，對禽類養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，因此世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須申報的動物疾病，中國政府也將其列為一類動物疫病，引起HPAI的毒株主要集中在H5和H7亞型[1-2]。

2013年，我國上海、江蘇和浙江等地先后發(fā)生H7N9禽流感病毒感染人事件，并引起死亡[3]。分子流行病學資料表明，2017年從病人體內分離的H7N9病毒出現血凝素裂解位點突變，該突變提示病毒致病性可能發(fā)生變化，進一步危害公共衛(wèi)生安全[4]。

本研究以禽流感病毒H7N9亞型HA裂解位點和NA基因為檢測靶標，以實時熒光定量PCR為模型，建立一種敏感、特異、多重高效的流感病毒核酸檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

引物和探針委托華大基因合成；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶采購自takara公司；PCR常規(guī)試劑均采購自賽默飛公司；H7N9病毒和其他常見禽病病毒核酸由中國科學院微生物研究所饋贈。

1.2 方法

1.2.1 引物探針制備

參考GenBank毒株序列KY643843.1、KF922738.1、KY643847.1，使用NCBI提供的在線工具Primer-BLAST進行引物探針設計。

1.2.2 陽性對照制備

參考GenBank毒株序列KY643843.1、KF922738.1、KY643847.1，設計引物擴增H7N9經典毒株HA基因，變異毒株HA基因和NA基因，并將3個基因片段連接到pUC57質粒。用常規(guī)方法提取質粒，并用無Rnase純化水稀釋至2×106copies/μL，置-20℃以下保存。

1.2.3 陰性對照制備

量取1 mL焦炭酸二乙酯迅速加入裝有1 000 mL去離子水的瓶中，封口，震蕩混勻，2℃～8℃放置8～16 h。121℃高壓滅菌25 min，置-20℃以下保存。

1.2.4 RT-PCR反應條件及閾值判定

根據不同探針設置對應的熒光通道，確定RT-PCR反應程序及方法閾值。

1.2.5 敏感性試驗

將H7N9經典毒株和變異毒株核酸混合，按10倍梯度進行稀釋，用本方法檢測。

1.2.6 特異性試驗

使用該方法檢測H5、H9等其他亞型禽流感病毒，以及其他禽類常見病毒核酸，包括H7N9變異毒株、H7N9經典毒株、新城疫病毒、傳染性法式囊病病毒、禽白血病病毒、禽傳染性支氣管炎病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒。

2 試驗結果

2.1 引物探針制備

用于檢測H7N9病毒HA基因的引物對及其探針序列如下：H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’；H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’；H7-P：5’-ROX-ACATAGATAGCAGGGC-BHQ2-MGB-3’；ROX為熒光基團，BHQ-2為淬滅基團。

用于檢測H7N9變異毒株HA基因的引物對及其探針序列如下：H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’；H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’；H7變異-P：5’-FAM-AGAGAAAACGGACTGC-BHQ1-MGB-3’；FAM為熒光基團，BHQ-1為淬滅基團。

用于檢測H7N9病毒NA基因的引物對及其探針序列如下：N9-F：5’-ATGCCCAGTAGTGTTCACCG-3’；N9-R：5’-TGTCCTCCCTAGCCAAGTGT-3’；N9-P：5’-VIC-GTCTCTGACTGGAACT-BHQ1-MGB-3’；VIC為熒光基團，BHQ-1為淬滅基團。

上述引物和探針由華大基因公司合成。

2.2 RT-PCR反應程序

在熒光定量PCR儀上運行以下程序：42℃30 min，95℃3 min；然后進行94℃10 s，60℃30 s；40個循環(huán)。熒光通道選擇FAM、VIC、ROX，其中FAM用于檢測突變毒株HA基因，ROX用于檢測野生株HA基因，VIC用于檢測NA基因，在每個循環(huán)的60℃時收集熒光信號。設置擴增體系為20 μL，同時要選擇passive reference和quencher為none的模式。

2.3 基線和閾值設定

基線調整取6～15個循環(huán)的熒光信號，閾值設定原則以閾值線剛好超過陰性對照檢測熒光曲線的最高點；質量控制：反應結束后，陰性對照的檢測結果應無特定的擴增曲線或Ct值>37或無；陽性對照Ct值均≤30.0，且出現三條明顯的擴增曲線，否則實驗視為無效；樣品判定：待檢樣品若FAM、ROX和VIC三條通道熒光信號均有指數型增加，且結果均顯示Ct值<34.0，則報告為高致病H7N9陽性；待檢樣品若ROX和VIC兩條通道熒光信號均有指數型增加，且結果均顯示Ct值<34.0，則報告為低致病H7N9陽性；待檢樣品若Ct值>37.0或無明顯擴增曲線時報告為陰性；34≤Ct值≤37時，復檢一次，重復結果為陽性者判定為陽性，否則判定為陰性。

2.4 敏感性試驗

將H7N9經典毒株和變異毒株陽性核酸混合，按10倍梯度進行稀釋。用本方法檢測稀釋樣本，靈敏度可以達到100～101個EID50。

2.5 特異性試驗

本方法具有良好的特異性，檢測結果不受其他亞型流感病毒以及常見禽類病毒的干擾，并且能夠鑒別在對H7N9變異毒株和經典毒株核酸樣本。

3 討論

本研究開發(fā)了一種用于檢測H7N9禽流感病毒經典毒株和變異毒株的多重熒光RT-PCR核酸檢測試劑盒，利用多重熒光RT-PCR技術，可快速、高效地甄別人和動物中的H7N9低致病性經典毒株和高致病性變異毒株。本研究以H7N9禽流感病毒HA裂解位點突變位置的基因序列為分子標識設計MGB探針，建立H7N9病毒經典毒株和變異毒株血凝素(HA)雙重檢測體系，然后結合保守的神經氨酸酶(NA)基因檢測體系，組成三重熒光RT-PCR檢測方法。

本研究使用MGB-Taqman探針，克服了多重PCR引物、探針、目的產物相互干擾等問題。探針3’末端使用BHQ作為淬滅基團，而BHQ本身不產生熒光，熒光背景低，靈敏度高；在傳統(tǒng)Taqman探針基礎上，MGB-Taqman探針在3’末端偶聯MGB (Minor Groove Binder)。MGB能夠與DNA的小溝結合，使探針與靶DNA形成極為穩(wěn)定的異源雙鏈，從而可將Tm值提高約10℃，大大提高了熒光PCR方法的特異性；MGB探針較短(14～20bp)，因而更適合于短小變異序列的特異性識別，容易設計。而且3’端淬滅基團與3’端報告基因在空間的位置更接近，實驗結果更精確，分辨率更高。