間隙連接蛋白Connexin 43介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥研究進(jìn)展

覃虹錕，桂艷萍，王亞菁，趙 麗*

(中國(guó)藥科大學(xué) 1江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院生理學(xué)教研室，南京 210009)

膠質(zhì)瘤是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。在我國(guó)每年大約有10萬(wàn)人被確診為膠質(zhì)瘤，超過(guò)6萬(wàn)人因膠質(zhì)瘤死亡，膠質(zhì)瘤防治工作形勢(shì)嚴(yán)峻[1]。目前膠質(zhì)瘤的臨床治療以手術(shù)、化療和放療聯(lián)合治療為主；盡管如此，患者的無(wú)進(jìn)展生存期約為5～7個(gè)月，中位生存期也僅停留在12～14個(gè)月，5年生存率低至3%～5%[2]。

替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是我國(guó)治療膠質(zhì)瘤的一線用藥，單用或與放療聯(lián)用治療新診斷的神經(jīng)膠質(zhì)瘤[3]，其能透過(guò)血-腦脊液屏障到達(dá)病灶，并通過(guò)烷化DNA起到抗腫瘤作用[4]。替莫唑胺的應(yīng)用顯著提高了膠質(zhì)瘤患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期，然而臨床數(shù)據(jù)顯示，僅有45%的患者對(duì)替莫唑胺產(chǎn)生響應(yīng)，且隨著用藥時(shí)間推移，響應(yīng)率逐步降低，患者出現(xiàn)耐藥[5]。為了提高替莫唑胺的療效，各國(guó)學(xué)者對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行了深入探究，以求延長(zhǎng)患者生命。

Cx43是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最豐富的間隙連接蛋白[6]，其與膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為有著密切聯(lián)系[7]，近年來(lái)的研究表明Cx43可能是影響替莫唑胺療效的原因之一。本文主要對(duì)Cx43與膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的關(guān)系的研究進(jìn)行總結(jié)，以期為提高替莫唑胺療效提供理論參考和依據(jù)。

1 間隙連接與Cx43

間隙連接是哺乳動(dòng)物細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞的重要通道。6個(gè)相同的間隙連接蛋白排列形成中心孔徑為2～4 nm的連接子形成半通道，可與相鄰細(xì)胞的細(xì)胞膜上的半通道組成通道[8]。離子(Na+、K+、Ca2+、Cl-)，第二信使[環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸尿苷(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)]，小分子代謝物(葡萄糖、氨基酸)和microRNA等物質(zhì)可通過(guò)間隙連接在細(xì)胞間傳遞，從而保證細(xì)胞間電耦合或生化耦合以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[7]。人類基因組中有21種連接蛋白編碼基因[9]，其中由GJA1基因編碼的Cx43是人體組織中表達(dá)最豐富的間隙連接蛋白。Cx43的肽鏈由N末端、2個(gè)胞外環(huán)、4個(gè)跨膜區(qū)域、1個(gè)胞內(nèi)環(huán)及C末端組成[10]，其中2個(gè)胞外環(huán)和C末端是Cx43發(fā)揮功能的主要區(qū)域，決定著間隙連接通道的形成及其功能(圖1)[11]。

Cx43在膠質(zhì)瘤發(fā)生、惡性增殖、侵襲以及耐藥中起重要作用[12-15]。Crespin等[16]對(duì)85例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤手術(shù)樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)約60%的膠質(zhì)瘤樣本存在Cx43蛋白高表達(dá)，且表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)。但是，Caltabiano等[17]對(duì)32例星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Cx43蛋白表達(dá)與惡性程度呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)對(duì)腫瘤和腫瘤基因圖譜(Cancer Genome Atlas,TCGA)和R2 database的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中的GJA1 mRNA表達(dá)顯著高于正常腦組織，且高表達(dá)GJA1的膠質(zhì)瘤患者總生存期顯著低于低表達(dá)患者。Cx43在膠質(zhì)瘤中表達(dá)差異較大，這可能和膠質(zhì)瘤發(fā)展過(guò)程及其所處的微環(huán)境密切相關(guān)。

Figure1 Schematic of Connexin 43 (Cx43)

2 替莫唑胺耐藥的分子機(jī)制

替莫唑胺作為一種能透過(guò)血-腦脊液屏障的烷化劑，通過(guò)烷基化DNA分子上鳥(niǎo)嘌呤第6位氧原子上和第7位氮原子發(fā)揮細(xì)胞毒作用，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[18]。

2.1 DNA損傷修復(fù)

O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)是膠質(zhì)瘤患者出現(xiàn)替莫唑胺耐藥的最主要原因。MGMT通過(guò)不可逆地將烷化基團(tuán)從O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤(O6-MeG)殘基轉(zhuǎn)移到MGMT 蛋白145位的半胱氨酸殘基以修復(fù)替莫唑胺帶來(lái)的DNA損傷[19]。近年來(lái)，研究者通過(guò)甲基化特異性PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤級(jí)別與MGMT啟動(dòng)子甲基化程度呈顯著負(fù)相關(guān)，與MGMT蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，且在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中沉默MGMT基因能顯著提高替莫唑胺治療效果[18,20-21]。Hirohata等[22]通過(guò)分析膠質(zhì)瘤手術(shù)樣本發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)蛋白6(mismatch repair protein，MSH6)也能修復(fù)替莫唑胺造成的DNA損傷，降低替莫唑胺藥效。隨著研究的深入，MutL homolog 3(MLH3)、ERCC家族和XRCC家族等DNA損傷修復(fù)蛋白在化療耐藥中的作用也逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，可能成為逆轉(zhuǎn)替莫唑胺耐藥的靶點(diǎn)[23-25]。

Figure2 Relative expression of gap junction protein,alpha-1 (GJA1) in glioblastoma multiforme (GBM) and normal brain (left).Pateint data was retrieved from Cancer Genome Atlas (TCGA).Kaplan-Meier overall survival analyses of GJA1 low (red) and GJA1 high (blue) glioma patients.The survival time of glioma patients (x-axis) is defined as months after diagnosis(right).Pateint data was retrieved from the R2 database

2.2 ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外排

膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)替莫唑胺的藥物濃度取決于細(xì)胞對(duì)于藥物的攝取和外排。替莫唑胺是一種親脂性分子，可以通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸攝入細(xì)胞內(nèi)，但是細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可通過(guò)外排作用降低細(xì)胞內(nèi)替莫唑胺濃度，其中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette，ABC)家族發(fā)揮重要作用[26]。P-糖蛋白(P glycoprotein,P-gp)是一種由MDR1基因編碼的ATP依賴型排出性膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。通過(guò)對(duì)112例手術(shù)樣本進(jìn)行分析，Schaich等[27]發(fā)現(xiàn)MDR1基因表達(dá)水平高的膠質(zhì)瘤患者對(duì)替莫唑胺響應(yīng)率較低，預(yù)后差。Munoz等[28]用P-gp抑制劑聯(lián)合替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行處理，相比替莫唑胺單用組，聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)增加，凋亡增加。除P-gp外，多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、肺癌耐藥性相關(guān)蛋白(lung resistance related protein,LRP)和ABCG2(ATP-binding Cassette Sub-family G Member 2)等外排蛋白在膠質(zhì)瘤中表達(dá)均有增加，和替莫唑胺耐藥密切相關(guān)[29-31]。

2.3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬

自噬是細(xì)胞遇到缺氧、輻射、饑餓或DNA損傷等情況下采取的一種自我保護(hù)機(jī)制，其通過(guò)形成自噬體包裹目標(biāo)細(xì)胞器或胞質(zhì)內(nèi)的大分子物質(zhì)，再由自噬體與溶酶體結(jié)合降解這些細(xì)胞中多余的或已失去功能的內(nèi)容物，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[32-33]。近年來(lái)研究表明，治療劑量(每日75 mg/m2)下替莫唑胺能導(dǎo)致O6-MeG損傷并誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬，引起替莫唑胺耐藥[34]。對(duì)于不可手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤患者，臨床多采用放療聯(lián)合替莫唑胺化療的方式進(jìn)行治療[4]，放療作為一種強(qiáng)大的DNA損傷途徑能引發(fā)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬[35]，這種自噬也可能是導(dǎo)致替莫唑胺耐藥的一大原因。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)使用氯喹(chloroquine)等自噬抑制劑均能顯著增強(qiáng)替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤的凋亡作用[36-38]。截至2018年9月，已有2項(xiàng)氯喹聯(lián)合替莫唑胺的治療方案分別進(jìn)入Ⅰ期臨床(NCT02378532)和Ⅲ期(NCT03243461)臨床試驗(yàn)階段[39-40]。

3 Cx43介導(dǎo)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的研究

膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺耐藥不僅是單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)行為，還需將腫瘤細(xì)胞置于所處的微環(huán)境中，考慮腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，甚至腫瘤細(xì)胞和周?chē)|(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。

3.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞間Cx43介導(dǎo)替莫唑胺耐藥

Cx43作為細(xì)胞膜上的通道蛋白，大量研究表明其表達(dá)或功能異常可能是導(dǎo)致替莫唑胺耐藥的重要原因。在LN229膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Cx43能顯著降低Bax/Bcl-2蛋白的比例，并減少線粒體細(xì)胞色素C的釋放，導(dǎo)致替莫唑胺耐藥[15,41]。Munoz 等[42]隨后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)替莫唑胺長(zhǎng)期處理后的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞Cx43表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)EGFR1-JNK-ERK-AP1軸形成耐藥性，敲除Cx43后，替莫唑胺誘導(dǎo)的凋亡顯著增加。Beahm等[43]通過(guò)構(gòu)建Cx43 C末端截短突變，發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)減弱Cx43與ZO-1、PKC和β-catenin等蛋白相互作用影響其通道與非通道功能；將Cx43第154位蘇氨酸定點(diǎn)突變?yōu)楸彼?T154A)，可以使相鄰細(xì)胞間形成正常間隙連接通道，但不具備胞間通訊功能[44]；在此基礎(chǔ)上，Gielen等[15]發(fā)現(xiàn)完整的Cx43 C末端結(jié)構(gòu)和Cx43介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊是其導(dǎo)致膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的重要因素。同樣，使用間隙連接抑制劑甘珀酸(carbenoxolone,CBX)后在體內(nèi)外都顯著增強(qiáng)了替莫唑胺的藥效[45-46]。為了研究Cx43與MGMT的關(guān)系，Lai等[47]通過(guò)體外誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其Cx43和MGMT的表達(dá)均顯著增加。但也有研究指出在MGMT缺失的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，高表達(dá)Cx43的細(xì)胞可通過(guò)激活A(yù)KT-AMPK-mTOR通路降低對(duì)替莫唑胺敏感性[48]。綜上所述，Cx43介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥可能不是依賴MGMT的，而可能與其形成的間隙連接通道和C末端活性形式相關(guān)。

3.2 膠質(zhì)瘤與周?chē)?xì)胞間Cx43介導(dǎo)替莫唑胺耐藥

在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中存在著大量的基質(zhì)細(xì)胞，包括膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞[49]。膠質(zhì)瘤與周?chē)?xì)胞間基于Cx43形成的間隙連接可能也是影響膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的原因。

腦組織中膠質(zhì)細(xì)胞分布最廣，約占人腦體積的50%，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞又是膠質(zhì)細(xì)胞中比例最大的細(xì)胞[50]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，參與形成血-腦脊液屏障，可通過(guò)調(diào)節(jié)鈣濃度和釋放膠質(zhì)遞質(zhì)調(diào)節(jié)腦部血流及神經(jīng)元之間的物質(zhì)代謝，參與了神經(jīng)循環(huán)的形成[51-53]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦部損傷、缺血、感染和腫瘤等作用下能被活化，以保護(hù)正常腦組織[54-55]。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)旁分泌和間隙連接作用上調(diào)黑色素瘤和乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞的生存基因，并提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性[6,56-58]。在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中，腫瘤周?chē)男切文z質(zhì)細(xì)胞被激活，Cx43表達(dá)上調(diào)[13]。在體外將星形膠質(zhì)細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)模擬膠質(zhì)瘤微環(huán)境，Yang等[59]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺敏感性降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Cx43介導(dǎo)的間隙連接降低了膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺的敏感性，給予CBX后膠質(zhì)瘤恢復(fù)對(duì)替莫唑胺的敏感性，同時(shí)RNA微陣列分析的結(jié)果顯示，共培養(yǎng)后膠質(zhì)瘤與星形膠質(zhì)細(xì)胞形成間隙連接，導(dǎo)致其中一些耐藥基因上調(diào)，抗凋亡基因下調(diào)[60]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Ca2+濃度也是影響其耐藥的重要原因[61]，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)與膠質(zhì)瘤形成間隙連接，降低膠質(zhì)瘤中Ca2+濃度，減少替莫唑胺引起的凋亡[62]。此外，microRNA也可通過(guò)間隙連接通道在星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞間傳遞[63]，這可能也是影響膠質(zhì)瘤耐藥的重要原因。

除星形膠質(zhì)細(xì)胞外，小膠質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞等與膠質(zhì)瘤通過(guò)間隙連接相互作用的現(xiàn)象也逐漸被揭示[64-67]，但少有關(guān)于替莫唑胺耐藥的研究，周?chē)?xì)胞介導(dǎo)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 以Cx43為靶點(diǎn)的抗腫瘤候選化合物

Cx43在膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥中發(fā)揮重要作用，但從治療的角度來(lái)看，因其在全身表達(dá)，同時(shí)也是膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)代謝廢物、傳遞信號(hào)，確保心臟細(xì)胞收縮同步的重要蛋白，使其成為一個(gè)極有挑戰(zhàn)性的藥理靶點(diǎn)。CBX是目前研究中使用較多的間隙連接抑制劑，但由于其不能透過(guò)血-腦脊液屏障[68]，限制了其在臨床上的使用。隨著藥物研究的深入，發(fā)現(xiàn)了一些臨床使用的藥物能透過(guò)血-腦脊液屏障并有一定的間隙連接抑制作用，如托那博沙(tonabersat)、甲氯滅酸鈉(meclofenamate)等，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示這些藥物能顯著增強(qiáng)化療藥物的治療效果[6]，這也為老藥新用提供了研究思路。近年來(lái)，Cx43的結(jié)構(gòu)逐漸被解析出來(lái)，一些特異性作用于Cx43蛋白結(jié)構(gòu)的抑制劑逐漸被發(fā)現(xiàn)。研究人員用聚乙二醇化脂質(zhì)體包裝重組單抗作用于Cx43的胞外域，發(fā)現(xiàn)其在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中抑制了膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)[69-70]。Cx43的C末端也是其發(fā)揮功能的重要區(qū)域，可與c-Src、PKC、AKT和AMPK等信號(hào)分子相互作用[71]，調(diào)節(jié)其通道功能和亞細(xì)胞定位等，并引發(fā)替莫唑胺耐藥[72]，運(yùn)用αCT1肽模擬Cx43的C末端在體內(nèi)外均能顯著提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性[48]。Cx43的胞內(nèi)環(huán)也與其通道功能密切相關(guān)，運(yùn)用L2和Gap19等模擬肽均能抑制其通道活性并減少膠質(zhì)瘤與星形膠質(zhì)細(xì)胞間的物質(zhì)交換[73-74]。此外，許多天然藥物也能非特異性的調(diào)節(jié)間隙連接，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖并增強(qiáng)抗腫瘤藥物的活性，如表1所示。天然藥物以其不良反應(yīng)小的特點(diǎn)著稱，若對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造增強(qiáng)其透過(guò)血-腦脊液屏障能力、改善腦部分布，天然藥物有望成為一類逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的重要藥物。

Table1 Natural anti-tumor compounds targeting Cx43

NameTumorReferenceTotal Flavonoids of Litsea core-anaTesticular cancer[75]TretinoinProstate cancer[76]BaicaleinCervical cancer[77]QuercetinBreast cancer[78]QuinolinesBreast cancer[79]

5 總 結(jié)

近年來(lái)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的研究有了很大進(jìn)展，而其中Cx43介導(dǎo)耐藥的作用也逐漸被揭示。但膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，使耐藥性的發(fā)生并不僅受某種單一因素調(diào)控，具體的發(fā)生機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究，如小膠質(zhì)或腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過(guò)間隙連接通道與膠質(zhì)瘤相互作用介導(dǎo)耐藥的機(jī)制以及以Cx43為靶點(diǎn)的藥物研究和優(yōu)化等，這些成果有望為膠質(zhì)瘤臨床治療提供新的理論依據(jù)以及候選治療藥物。