富硒黃芪提取物對(duì)鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響

李永榮，程 濤，王永勝，李 欽，高 博，賀 云，白 宇

(1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，蘭州 730020；2甘肅省中醫(yī)藥研究院，蘭州 730050；3甘肅省中醫(yī)院，蘭州 730050；4甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，蘭州 730200；5甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是組織對(duì)胰島素反應(yīng)不靈敏，胰島素受體后信號(hào)傳導(dǎo)障礙所導(dǎo)致[1]。機(jī)體長(zhǎng)期處于代償性高胰島素狀態(tài)，隨著胰島功能減退，胰島素分泌出現(xiàn)相對(duì)不足從而誘發(fā)2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)[2]。改善胰島素抵抗是緩解T2DM重要策略[3]。目前改善T2DM胰島素抵抗藥物主要通過提高胰島素分泌和增加外周胰島素靶器官的胰島素敏感性實(shí)現(xiàn)的[4-5]。臨床用藥以化學(xué)藥為主，中藥為輔。T2DM是慢性疾病，需長(zhǎng)期服藥，對(duì)于我國糖尿病患者，化學(xué)藥價(jià)格昂貴，藥費(fèi)是一筆巨大的開支，由此所導(dǎo)致的用藥持續(xù)性降低，將使藥效不盡如人意[6-7]。因此，在我國中醫(yī)寶庫中尋找對(duì)T2DM療效好、價(jià)格便宜的藥物變得尤為重要和迫切。國內(nèi)不少學(xué)者也在努力從中藥開發(fā)治療T2DM藥物[8-9]。黃芪作為常用中藥，性溫味甘，歸肺、脾經(jīng)，有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之效。黃芪具有很強(qiáng)的硒富積能力，硒可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力和免疫力，以黃芪為載體富積硒元素生產(chǎn)富硒黃芪將會(huì)有更高的藥用價(jià)值[10]。研究發(fā)現(xiàn)黃芪提取物成分有毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、總皂苷、總黃酮、總酚酸、總多糖[11]，其中主要含有皂苷(9.01%)、黃酮(8.12%)、多糖(81.12%)以及酚酸(1.75%)，現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，黃芪中提取的黃芪多糖、皂苷、黃酮等化合物具有增強(qiáng)免疫功能、抗細(xì)胞凋亡、抗應(yīng)激、抗衰老、保護(hù)心肌細(xì)胞及改善心功能和心肌纖維化、保肝、利尿、降壓降脂以及抗炎等多種藥理作用[12-14]。但是富硒黃芪提取物的主要成分及其藥理作用并未有人進(jìn)行研究，對(duì)T2DM胰島素抵抗的影響尚未見報(bào)道。本研究將以鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠為研究對(duì)象，探索富硒黃芪提取物對(duì)胰島素抵抗的作用，為富硒黃芪提取物改善胰島素抵抗提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究富硒黃芪提取物成分及其各成分藥理作用提供理論參考。

1 材 料

1.1 藥物與試劑

富硒黃芪，產(chǎn)地甘肅渭源，由渭源縣康榮中藥材科技有限公司培育；提取物的制備：將藥材粉碎過10目篩，加水浸泡30 min，經(jīng)超聲提取2次，每次45 min，然后合并濾液，濃縮，濾過，加適量蒸餾水，將溶液pH調(diào)至近中性，G4垂熔玻璃漏斗濾過，使其成為1 g/mL水溶液，滅菌，冷藏備用。使用前用生理鹽水稀釋成40 mg/mL。

胰島素(insulin)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒、C反應(yīng)蛋白(CRP)ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物有限公司；兔抗胰島素受體底物蛋白1(IRS1)多克隆抗體、兔抗磷酸化IRS1(p-IRS1)多克隆抗體、兔抗核因子κB抑制子激酶β(IKKβ)單克隆抗體、兔抗磷酸化IKKβ(p-IKKβ)多克隆抗體、兔抗c-Jun氨基末端激酶(JNK1)單克隆抗體、兔抗磷酸化JNK1(p-JNK1)多克隆抗體均購自英國Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(中國碧云天生物科技有限公司)。

1.2 儀 器

血糖儀(德國羅氏公司)；2700型全自動(dòng)生化儀(日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)；電泳裝置、轉(zhuǎn)膜裝置、電泳儀(北京六一公司)。

1.3 動(dòng) 物

SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，7～8周齡，SPF級(jí)動(dòng)物房條件下飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005。

2 方 法

2.1 造 模

參照文獻(xiàn)造模[15]：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，空白組10只，其余給予高糖高脂飼料(配方：18%豬油，20%蔗糖，3%膽固醇，基礎(chǔ)飼料59%)，4周末根據(jù)血脂含量對(duì)大鼠進(jìn)行篩選，選擇高血脂大鼠尾靜脈注射STZ(25 mg/kg)，1周后取尾靜脈血測(cè)定血糖，隨機(jī)血糖穩(wěn)定大于16.7 mmol/L者診斷為2型糖尿病，未成功模型追加注射1次STZ(12.5 mg/kg)，最終有72只成模，成模率為90.00%。篩選造模成功的大鼠50只，隨機(jī)分為模型組、藥物組[富硒黃芪提取物低(LESAM)、中(MESAM)、高劑量(HESAM)]、陽性對(duì)照組(吡格列酮)，每組10只。

2.2 分組給藥

參照文獻(xiàn)[16]：LEASM、MESAM、HESAM組分別按100，200，400 mg/kg體質(zhì)量灌胃；正常組、模型組灌服相同體積的生理鹽水；陽性對(duì)照組按10 mg/kg灌服吡格列酮。每日1次，連續(xù)4周。

2.3 一般情況與體質(zhì)量

觀察大鼠一般狀況、飲水量、攝食量、體質(zhì)量、隨機(jī)血糖。其中體質(zhì)量在造模前1次、造模后第0，2，4周各1次分別檢測(cè)記錄。

2.4 樣本采集

給藥4周末，禁食不禁水12 h，測(cè)定空腹血糖和體質(zhì)量后，4%水合氯醛麻醉大鼠，摘眼球采血，分離血清，-20 ℃保存。采血后處死大鼠，分離肝臟，將肝臟切成若干份，根據(jù)不同檢測(cè)方法，分別置于液氮中儲(chǔ)存，待檢測(cè)。

2.5 空腹血糖(FBG)和空腹胰島素(FINS)檢測(cè)

禁食不禁水12 h，F(xiàn)BG采用尾靜脈取血法在造模前1次、造模后第0、2、4周各1次分別檢測(cè)記錄。FINS采用放射性免疫吸附法在灌藥4周末，禁食不禁水12 h，采血進(jìn)行檢測(cè)。胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)評(píng)估模型(homeostesis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)=(FBG×FINS)/22.5[17]。

2.6 血清生化指標(biāo)檢驗(yàn)

采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)給藥4周后采集的血清中總膽固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。

2.7 血清中TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β檢測(cè)

根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。簡(jiǎn)要步驟如下：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)孔加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣品孔以每孔50 μL加入待測(cè)樣品，以不加樣品和酶標(biāo)試劑的孔作為空白孔，37 ℃孵育30 min，洗滌甩干，加酶標(biāo)試劑50 μL，孵育后洗滌甩干，顯色15 min，終止后450 nm處于酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸收度。

2.8 肝臟組織中IRS1、p-IRS1、IKKβ、p-IKKβ、JNK、p-JNK蛋白檢測(cè)

取新鮮液氮速凍的肝臟組織，PBS洗滌后，組織中加入預(yù)冷RIPA裂解液在冰上研碎，待裂解后收集于離心管中，繼續(xù)裂解30 min，13 000 r/min離心，收集上清，測(cè)定蛋白濃度，加入4×上樣緩沖液，煮沸5 min，充分變性，-20 ℃保存?zhèn)溆?。制膠：10%分離膠+5%濃縮膠；按蛋白濃度確定上樣量；然后經(jīng)過電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育過夜(IRS1、p-IRS1、IKKβ、p-IKKβ抗體均以1∶2 000稀釋；JNK1、p-JNK1抗體均以1∶1 500稀釋；內(nèi)參以1∶3 000 稀釋)，PBS洗滌，二抗(以1∶6 000稀釋)室溫孵育1.5 h，PBS洗滌，ECL發(fā)光液顯色，X射線片顯影，拍照。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 ESAM對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠一般情況的影響

正常組大鼠行動(dòng)活躍、毛色光澤、精神狀態(tài)良好、行動(dòng)敏捷、反應(yīng)靈敏，尿量、飲食正常。模型組大鼠毛色灰暗、行動(dòng)遲緩、精神不佳、對(duì)外界刺激不靈敏、活動(dòng)少，尿量和飲食量增加。給予藥物干預(yù)后，各干預(yù)組大鼠與模型組相比，毛色、活動(dòng)量、靈敏度、精神狀態(tài)以及尿量和飲食量均出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)，其中ESAM高劑量組大鼠與吡格列酮組在各項(xiàng)指標(biāo)的恢復(fù)程度上無明顯區(qū)別。

3.2 ESAM對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體質(zhì)量、FPG、FINS以及HOMA-IR的影響

與正常組相比，模型組體質(zhì)量顯著下降(P<0.01)，血液中FPG顯著上升(P<0.05)，HOMA-IR顯著增大(P<0.01)，血液中FINS無顯著變化(P>0.05)；與模型組相比，陽性藥物組、ESAM中、高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著上升(P<0.05)，血液中FPG含量顯著下降(P<0.05)，血液中FINS無顯著變化(P>0.05)，HOMA-IR顯著降低(P<0.05)，其中ESAM高劑量組大鼠與吡格列酮組在各項(xiàng)指標(biāo)上無顯著區(qū)別。

GroupDose/(mg/kg)Body mass/gFPG/(mmol/L)FINS/(mU/L)HOMA-IRBlank-387.5±50.65.45±0.3216.32±3.733.95±0.05Model-227.6±33.2##24.14±2.85##18.94±3.1220.32±0.40##Pioglitazone10304.1±37.8**7.33±0.89**20.13±4.096.55±0.16**LESAM100236.7±29.819.57±3.4119.35±3.8216.83±0.58*MESAM200267.8±33.1*15.43±2.89*20.11±3.1613.79±0.41*HESAM400294.4±34.6**11.76±1.56**20.53±4.4610.73±0.31**

LESAM:Low-dose group of extract of selenium-enrichedAstragalusmembranaceus(ESAM);MESAM：Medium-dose group of ESAM;HESAM:High-dose group of ESAM;FPG:Fasting plasma glucose;FINS:Fast serum insulin

##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.3 ESAM對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠CHOL、TG、HDL以及LDL的影響

與正常組相比，模型組大鼠血液中CHOL、TG、HDL含量顯著上升(P<0.05)，HDL無顯著變化(P>0.05)；與模型組相比，陽性藥物組、ESAM中、高劑量組大鼠血液中CHOL、TG、HDL含量顯著下降(P<0.05)，HDL含量無顯著變化(P>0.05)。ESAM高劑量組大鼠與吡格列酮組在各項(xiàng)指標(biāo)上無顯著區(qū)別。

GroupDose/(mg/kg)CHOL/(mmol/L)TG/(mmol/L)HDL/(mmol/L)LDL/(mmol/L)Blank-1.73±0.090.77±0.321.01±0.240.37±0.02Model-2.68±0.18##1.98±0.24##1.26±0.190.68±0.08##Pioglitazone101.76±0.17**0.89±0.11**1.23±0.210.41±0.06**LESAM1002.54±0.311.92±0.181.34±0.200.59±0.05MESAM2002.01±0.16*1.54±0.21*1.11±0.110.47±0.03**HESAM4001.83±0.12**1.01±0.15**1.10±0.180.44±0.04**

CHOL:Cholesterol;TG:Triglyceride;HDL:High density lipoprotein;LDL:Low density lipoprotein

##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.4 ESAM對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠肝臟組織中IRS1、p-IRS1的影響

IRS1總蛋白在各組大鼠肝臟組織中無顯著變化(P>0.05)；與空白組相比，模型組大鼠肝臟組織中p-IRS1蛋白含量顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性藥物組、ESAM中、高劑量組大鼠肝臟組織中p-IRS1含量顯著減少(P<0.05)。p-IRS1蛋白變化在ESAM高劑量組大鼠與吡格列酮組之間比較無顯著區(qū)別。

3.5 ESAM對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠肝臟組織中IKKβ/p-IKKβ、JNK/p-JNK蛋白的影響

IKKβ和JNK總蛋白在各組大鼠肝臟組織中無顯著變化(P>0.05)；與空白組相比，模型組大鼠肝臟組織中p-IKKβ、p-JNK蛋白含量顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性藥物組、ESAM中、高劑量組大鼠肝臟組織中p-IKKβ、p-JNK蛋白含量顯著減少(P<0.05)。各蛋白變化在ESAM高劑量組大鼠與吡格列酮組之間比較無顯著區(qū)別。

A:Western blot strips;B:Statistical analysis of Western blot strips

##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

A,B:Western blot strips;C,D:Statistical analysis of Western blot strips

##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.6 ESAM對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β顯著上升(P<0.05)；與模型組相比，陽性藥物組、ESAM中、高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β含量顯著下降(P<0.05)。各因子變化在ESAM高劑量組大鼠與吡格列酮組之間比較無顯著區(qū)別。

GroupDose/(mg/kg)TNF-α/(ng/L)IL-6/(ng/L)CRP/(ng/L)IL-1β/(ng/L)Blank-150.31±50.649.76±10.32846.71±89.6827.65±3.45Model-204.52±19.78##94.38±8.73##1738.67±134.56##43.16±4.12##Pioglitazone10163.41±25.56**58.44±9.67**1063.65±125.34**33.71±5.63**LESAM100198.78±30.1188.92±7.851689.57±135.5646.13±4.55MESAM200185.53±27.83*73.15±9.12*1367.21±113.67*36.89±3.78*HESAM400164.67±21.67**55.97±6.41**1121.67±134.78**35.27±5.69**

##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

4 討 論

IR是誘發(fā)T2DM的主要病因，其伴隨T2DM發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過程。目前對(duì)T2DM的治療藥物大部分都基于改善IR開發(fā)的。為研究富硒黃芪提取物對(duì)IR的作用，本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)，低劑量STZ注射損傷胰島β細(xì)胞建造T2DM模型，造模后，對(duì)比各組大鼠一般狀況發(fā)現(xiàn)與空白組大鼠相比，模型組大鼠毛色灰暗、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍。對(duì)FPG和FINS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與空白組相比，模型組FPG顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)INS略微上升(P>0.05)，HOMA-IR顯著升高(P<0.05)，可知雖然FINS分泌量有所升高，空腹血糖卻依然穩(wěn)定在高水平，導(dǎo)致INS相對(duì)不足，出現(xiàn)IR特征。以上結(jié)果初步提示T2DM建模成功。

進(jìn)一步本研究用不同濃度富硒黃芪提取物干預(yù)T2DM模型，經(jīng)過4周后檢測(cè)血液中FPG和FINS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，富硒黃芪提取物中、高劑量組大鼠血液中FPG含量顯著下降(P<0.05)、FINS含量各組間無顯著變化(P>0.05)，HOMA-IR顯著下降(P<0.05)，體重顯著上升(P<0.05)，提示富硒黃芪提取物可改善T2DM的IR，提高T2DM的INS敏感性，降低FPG。

肥胖是導(dǎo)致IR的重要原因。研究顯示[18]由肥胖所導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥因子分泌增加以及胰島素靶細(xì)胞信號(hào)通路異常、線粒體功能障礙均可引起IR。血清中游離脂肪酸(FFA)如CHOL、TG以及LDL含量變化是脂質(zhì)代謝紊亂的重要指標(biāo)。已有研究發(fā)現(xiàn)血液中高水平FFA可導(dǎo)致外周組織對(duì)胰島素敏感性下降，葡萄糖攝取減少[19-20]，長(zhǎng)期降低血液中FFA水平，可改善IR[21-22]。FFA導(dǎo)致IR的關(guān)鍵分子機(jī)制在于胰島素信號(hào)通路中IRS蛋白的化學(xué)修飾發(fā)生改變。一般情況下IRS1以ser307位點(diǎn)非磷酸化狀態(tài)存在，該狀態(tài)下胰島素信號(hào)通路激活，而FFA能通過活化IKKβ(ser181)和JNK(Thr183/Tyr185)介導(dǎo)IRS1 ser307位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致胰島素信號(hào)通路抑制[23-25]。炎癥因子可抑制甘油三脂合成，促進(jìn)脂解，導(dǎo)致血液中FFA水平上升，繼而引發(fā)IR[26-28]，同時(shí)炎癥因子也可直接對(duì)胰島素信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用[29]。為研究富硒黃芪提取物改善IR的分子機(jī)制，本研究對(duì)富硒黃芪提取物干預(yù)后的各組大鼠血液中FFA；肝臟組織中IRS1、p-IRS1、IKKβ/p-IKKβ和JNK/p-JNK蛋白；以及血清中TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β炎癥因子水平進(jìn)行檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠中CHOL、TG以及LDL含量顯著上升，富硒黃芪提取物中、高劑量可顯著降低T2DM大鼠血液中CHOL、TG以及LDL含量，對(duì)HDL影響不大。提示富硒黃芪提取物可通過降低T2DM大鼠血液中FFA含量對(duì)IR起一定的改善作用。對(duì)T2MD大鼠肝臟組織中IRS1、p-IRS1檢測(cè)發(fā)現(xiàn)富硒黃芪提取物對(duì)各組大鼠肝臟組織中總IRS1蛋白表達(dá)無顯著影響，各組間表達(dá)無差異。但與模型組相比，富硒黃芪提取物中、高劑量組肝臟組織中p-IRS1表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。在總IRS1蛋白不變的情況下，p-IRS1降低，則非磷酸化IRS1升高。進(jìn)一步檢測(cè)IKKβ、p-IKKβ和JNK、p-JNK蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)富硒黃芪提取物對(duì)T2DM大鼠肝臟組織中IKKβ和JNK總蛋白表達(dá)無影響，但可降低肝臟組織中p-IKKβ和p-JNK含量，其中與模型組相比，中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。綜上提示富硒黃芪提取物可降低T2DM大鼠血液中FFA含量，抑制IKKβ和JNK磷酸化活化，進(jìn)一步抑制IRS1的磷酸化，進(jìn)而改善T2DM大鼠的IR。

在炎癥水平上，本研究發(fā)現(xiàn)富硒黃芪提取物可降低T2DM大鼠血液中TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β炎癥因子的含量，提示富硒黃芪提取物可通過抑制T2DM大鼠炎癥因子，間接抑制由此介導(dǎo)的脂解和FFA水平或直接解除炎癥因子對(duì)胰島素通路的抑制，改善T2DM大鼠IR。

本研究還發(fā)現(xiàn)ESAM對(duì)T2DM模型胰島素抵抗的改善作用與目前臨床上使用的吡格列酮的改善作用相似，無顯著差別。加之ESAM作為中藥提取物可具有較低的不良反應(yīng)，因此具有較好的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，但需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，富硒黃芪提取物可通過降低T2DM大鼠炎癥因子的表達(dá)，抑制FFA的升高，降低周圍組織中IKKβ和JNK磷酸化活化，進(jìn)而激活胰島素通路，改善T2DM的IR作用。