環(huán)狀RNA：生物合成、功能及其在心血管疾病中的作用

胡楊兮，油紅敏，荊清

1 環(huán)狀RNA研究概況

細(xì)胞中的RNA可以分為編碼RNA和非編碼RNA兩種類型。其中非編碼RNA占98%以上，可根據(jù)功能、長度和結(jié)構(gòu)不同細(xì)分為轉(zhuǎn)運RNA(transfer RNA，tRNA，74～95bp)、核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA，121～5000bp)、小核RNA(small nuclear RNA，snRNA，100～300bp)、小核仁RNA(small nucleolar RNA，snoRNA，100～300bp)、指導(dǎo)RNA(guide RNA，gRNA，55～70bp)、微小RNA(microRNA，miRNA或miR，19～23bp)、piwi相互作用RNA(piwi-interacting RNA，piRNA，24～30bp)、小干擾RNA(small interfering，siRNA，21～25bp)、長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA，＞200bp，線性)和環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA，＞200bp，環(huán)狀)[1]。

1976年，研究者首次從RNA病毒中檢測到circRNA[2]，最初被認(rèn)為是線性RNA錯誤剪接的產(chǎn)物[3]而沒有引起研究者的注意。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的成熟及應(yīng)用，circRNA被發(fā)現(xiàn)與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其生物學(xué)功能也逐漸被揭示。如circITGA7可通過吸收miR-370，抑制其對靶基因NF1表達(dá)的下調(diào)，從而抑制結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[4]。在胰腺癌組織中的研究發(fā)現(xiàn)，circ_0006215可通過海綿機(jī)制下調(diào)miR-378a的表達(dá)，解除其對絲氨酸蛋白酶抑制蛋白A4(serine proteinase inhibitor A4，SERPINA4)基因表達(dá)的抑制作用[5]。小鼠中circ_015947同樣可以吸收miR-188、miR-329、miR-3057、miR-5098和miR-683，調(diào)控小鼠神經(jīng)元的缺血-再灌注損傷過程[6]。眾多研究表明，circRNA可以通過充當(dāng)miRNA海綿、競爭性結(jié)合信使RNA(message RNA，mRNA)、與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體等調(diào)控基因表達(dá)[7]，在轉(zhuǎn)錄方面調(diào)控mRNA的剪接、翻譯和降解，以及可以作為多種疾病的生物標(biāo)志物等[7]。

circRNA分子的結(jié)構(gòu)類似于一個封閉的環(huán)，不具有5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端多腺苷酸尾部，因此不容易被核酸外切酶降解[8]。由于circRNA不具有多聚腺苷酸尾部，常規(guī)的RNA提取方法無法精確地對其進(jìn)行提取，只有在提取總RNA后去除rRNA和具有多聚腺苷酸尾部的線性RNA才能大量富集circRNA[9]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在人們廣泛采用高通量測序和芯片分析方法大量而準(zhǔn)確地檢測circRNA。circRNA雖然表達(dá)豐度較低，但有時空特異性[10]。在人類心臟組織中，circRNA的表達(dá)多數(shù)與其同源mRNA相關(guān)[11]。有研究從鈣化的人主動脈瓣標(biāo)本中檢測到5476個circRNA，其中1412個具有主動脈瓣特異性[12]。circRNA因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，平均半衰期甚至長達(dá)50h[13-15]，因此在追蹤編碼基因進(jìn)行診斷時，相對于半衰期較短的線性mRNA而言，circRNA更具優(yōu)勢[16]。circRNA在外泌體中含量較豐富并可通過外泌體釋放到外周血[16]。除外周血外，去除細(xì)胞的唾液中也已經(jīng)檢測到400多種circRNA，可用于無創(chuàng)診斷[17]。目前，已經(jīng)建立了11個在線circRNA數(shù)據(jù)庫[18]，包括BBBomics、circ2Traits、circBase、circInteractome、circNet、circRNADb、CSCD、exorBase、PlantcircBase、Soma-miR和TSCD，可為研究者提供便捷的circRNA及相關(guān)通路檢索。通過對多種生物的circRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)circRNA在進(jìn)化上保守，性質(zhì)穩(wěn)定[19]，更顯示出circRNA作為疾病診斷工具的優(yōu)勢。

2 circRNA的生物合成

生物體內(nèi)大多數(shù)circRNA由線性前體RNA(premRNA)加工合成，這是通過多種非經(jīng)典的反向剪接方式完成的。circRNA生物合成主要有3種模型[19](圖1)。第1種被稱為“套索驅(qū)動環(huán)化(lariat-driven circularization)”或“外顯子跳躍(exon skipping)”模型，即在pre-mRNA合成過程中RNA被折疊，使得多個外顯子互相靠近、“跳躍”形成環(huán)形的RNA中間體，繼而通過套索樣剪接生成circRNA。第2種模型被稱為“內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化(intron-pairingdriven circularization)”或“直接后拼接(direct back splicing)”模型。這一模型中，反向互補(bǔ)的ALU序列存在于外顯子上下游的內(nèi)含子之中[20]，其互相配對介導(dǎo)了反向剪接形成circRNA。多種多樣的內(nèi)含子和ALU序列使配對存在選擇性和競爭性，導(dǎo)致同一個基因生成多種circRNA[20]，這一過程稱為“可變環(huán)化”。近年來，研究發(fā)現(xiàn)還存在著第3種環(huán)化方式：當(dāng)pre-RNA在某個外顯子附近存在7nt富含鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)的序列(GU-rich sequence)，另一外顯子附近存在11nt富含胞嘧啶(C)的序列(C-rich sequence)時，由剪接反應(yīng)產(chǎn)生內(nèi)含子套索的過程中，內(nèi)含子可避開脫支反應(yīng)，環(huán)化而形成穩(wěn)定的circRNA[21]。

圖1 circRNA生物合成途徑Fig.1 The biogenesis of circRNAs

circRNA按組成成分可分成3類。完全由外顯子構(gòu)成的circRNA稱為外顯子circRNA(exonic circRNAs，EcircRNAs)，同時含有外顯子和內(nèi)含子者稱為外顯子-內(nèi)含子circRNA(exonic-intronic circRNAs，EIcircRNAs)，完全由內(nèi)含子構(gòu)成者則稱為ciRNA(circular intronic RNAs，ciRNAs)[21]。根據(jù)circRNA的親本基因位置，又可將其分為基因內(nèi)(intragenic)circRNA和基因間(intergenic)circRNA[22]。每一個EcircRNA、EIcircRNA和ciRNA分子都源自同一個親本基因內(nèi)部的不同外顯子和(或)內(nèi)含子的拼接，因此都屬于基因內(nèi)circRNA；除此之外，來源于不同基因之間的基因組區(qū)間的circRNA則稱為基因間circRNA[23]。

circRNA的合成受多種因素調(diào)控。多種RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)可促進(jìn)環(huán)化過程，如RNA聚合酶Ⅱ(RNA Polymerase Ⅱ，RNA-polⅡ)[24]、Quaking蛋白(QKI protein)[10]、Muscleblind蛋白(MBL protein)[25]以及RNA結(jié)合基元蛋白20(RNA binding motif protein 20，RBM20)[26-27]等。作用于RNA的腺苷脫氨酶1(adenosine to inosine acting on RNA enzyme 1，ADAR1)則可抑制circRNA的合成[28]。

3 circRNA的功能

3.1 調(diào)控miRNA circRNA含有大量被稱為miRNA反應(yīng)原件(miRNA response elements，MREs)[29]的miRNA結(jié)合位點，在細(xì)胞質(zhì)中可抑制miRNA與其靶mRNA的結(jié)合，從而促進(jìn)或抑制靶基因的表達(dá)。circRNA可以具有多個miRNA的MREs，還可以具有針對單個miRNA的多個結(jié)合位點[1]。這種對miRNA的吸收作用被形象地稱為“miRNA海綿”作用[30]。經(jīng)典的miR-7的circRNA海綿(circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7)，也稱為miRNA海綿小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(cerebellar degenerationrelated protein 1 antisense，Cdr1as)可負(fù)性調(diào)節(jié)miR-7的表達(dá)[31]。Cdr1as含有超過70個miR-7結(jié)合位點，在HEK293細(xì)胞中高表達(dá)且在每個細(xì)胞中可以結(jié)合多達(dá)2萬個miR-7分子[32]；同時可以結(jié)合阿爾戈蛋白(Argonaute proteins，AGO)，在腦[30]、胰島[33]等組織吸收miR-7，抑制其對靶基因的負(fù)性調(diào)控作用。盡管海綿效應(yīng)是circRNA介導(dǎo)基因調(diào)控的經(jīng)典模型，但最近的一些研究表明，只有少數(shù)circRNA表現(xiàn)出miRNA海綿的特性，生理性circRNA表達(dá)變化對高表達(dá)的miRNA沒有影響[34-35]。少數(shù)circRNAs，如CDR1as和cSRY，含有超過10個特定miRNA的結(jié)合位點，被視為“超級海綿”[36]。除了簡單抑制外，circRNA與miRNA之間的相互作用還與miRNA的貯存、分選和定位有關(guān)[31]。

3.2 直接影響基因表達(dá) circRNA可通過調(diào)控線性RNA轉(zhuǎn)錄和可變剪接直接參與基因表達(dá)的調(diào)控。如外顯子跳躍模型中，前體RNA在環(huán)化形成ecircRNA的同時也可以進(jìn)行可變剪接形成成熟的線性RNA，如此ecircRNA的合成會競爭性地阻礙同源的線性RNA的合成[37]，但也有增加circRNA自身或其相應(yīng)線性RNA表達(dá)的報道[38]。另外，含有翻譯起始位點的pre-mRNA如發(fā)生環(huán)化而非線性剪接，意味著circRNA的形成減少了mRNA的形成和下游蛋白的翻譯，這種作用被稱為“mRNA陷阱”[39]。

3.3 調(diào)控蛋白質(zhì)功能 circRNA可以結(jié)合某些有關(guān)鍵作用的RNA結(jié)合蛋白，間接地調(diào)節(jié)基因表達(dá)[40]。既往研究業(yè)已報道多種circRNA可以結(jié)合蛋白因子如RNA-pol Ⅱ和AGO，作用于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域調(diào)控轉(zhuǎn)錄[21,31]。定位于核內(nèi)的circRNA可以與RNApol Ⅱ相互作用于其親本基因的啟動子區(qū)域并調(diào)節(jié)親本基因的轉(zhuǎn)錄[21,41]，這些circRNA包括EIcircRNA和ciRNA。比如circEIF3J和circPAIP2與小核核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs)U1結(jié)合形成EIciRNA-U1 snRNP復(fù)合物，然后該復(fù)合物可與位于其親本基因啟動子區(qū)域中的RNA-polⅡ相互作用，從而增強(qiáng)其親本基因的轉(zhuǎn)錄[41-42]。ciRNA c-sirt7可與RNA-pol Ⅱ延伸復(fù)合體相互作用，導(dǎo)致其親本基因錨蛋白重復(fù)域52(ankyrin repeat domain 52，ankrd52)及Sirtuin 7(SIRT7) mRNA明顯下調(diào)[21]。剪切因子MBL相關(guān)circRNA(MBL-related circular RNA，circMbl)可以結(jié)合MBL，調(diào)控自身的生物合成，形成一種RNA轉(zhuǎn)錄的自身調(diào)節(jié)機(jī)制[25]。叉頭盒O3相關(guān)circRNA(Forkhead box O3related circular RNA，circFoxo3)則能與周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinases 2，CDK2)蛋白和周期蛋白依賴性激酶P21(cyclin dependent kinase p21)蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，調(diào)控周期蛋白A(cyclin A)和周期蛋白E(cyclin E)等，從而影響細(xì)胞周期[43]。除此之外，circFoxo3還有助于結(jié)合周期蛋白依賴性激酶P53(cyclin dependent kinase p53)蛋白和小鼠雙微粒體(murine double minute 2，MDM2)蛋白，促進(jìn)P53蛋白的降解[44]。分化抑制蛋白1(inhibitor of differentiation protein 1，ID-1)、轉(zhuǎn)錄因子E2F1、黏附斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF1α)蛋白與circFoxo3的相互作用也有報道[44]。

3.4 編碼蛋白質(zhì) circRNA缺少編碼RNA的一些主要共性特征，如5'端m7GPPPN帽子結(jié)構(gòu)和3'端多聚腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)，所以一直被認(rèn)為屬于非編碼RNA。對腦心肌炎病毒的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA中存在多個內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(internal ribosome entry site，RES)，提示circRNA也可能有編碼蛋白的功能[45]。M6A修飾是最常見的RNA修飾，circRNA的m6A修飾能促進(jìn)自身的翻譯，首次證明了circRNA可以在外界刺激下表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽[46]。目前越來越多的circRNA表達(dá)蛋白被發(fā)現(xiàn)，比如：circ-ZNF609可以直接翻譯蛋白參與肌肉的發(fā)生過程[47]；果蠅大腦中發(fā)現(xiàn)circRNA翻譯生成的多種多肽和蛋白質(zhì)[48]；circ-FBXW7編碼的蛋白質(zhì)約含185個氨基酸，可通過降低c-Myc蛋白的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生[49]。研究者認(rèn)為這些circRNA的翻譯主要在膜核糖體進(jìn)行，且終止密碼子在進(jìn)化上保守[47-48]。circRNADb數(shù)據(jù)庫(http://reprod.njmu.edu.cn/circrnadb)更詳細(xì)地揭示了內(nèi)源性circRNA是否可以編碼哺乳動物細(xì)胞中的功能性蛋白質(zhì)的問題[50]。

3.5 其他功能 還有報道稱circRNA與假基因生成有關(guān)[51]。假基因是結(jié)構(gòu)上與通常的基因相似卻無特定的生物學(xué)功能的基因，一般情況下不進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，也被稱為“垃圾DNA”。假基因可通過DNA復(fù)制后因基因序列發(fā)生變化喪失蛋白質(zhì)編碼功能而產(chǎn)生，也可通過mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA爾后插入基因組造成序列錯亂而形成。研究人員分析了小鼠基因組中circRFWD2的相應(yīng)環(huán)化位點(外顯子6-外顯子2)，相信至少存在33個circRFWD2衍生的假基因[51]。通常情況下，由反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE-1介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄過程要求模板RNA存在多聚腺苷酸尾巴，而該研究發(fā)現(xiàn)與circRFWD2相關(guān)的假基因多數(shù)不存在多聚腺苷酸序列，說明circRFWD2可以通過某種未知的方式反轉(zhuǎn)錄為cDNA后整合到基因組中[52]。除circRFWD2之外，在小鼠基因組中發(fā)現(xiàn)的circSATB1，在某些細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)的circDIAP3和在人類基因組中發(fā)現(xiàn)的circPRKDC、circCAMSAP1都存在著衍生的假基因[52]，提示可能有更多circRNA通過反座過程改變基因組結(jié)構(gòu)。

4 circRNA與心血管疾病

世界衛(wèi)生組織(WHO)報告每年有近1750萬人死于心血管疾病[53]，心血管疾病已經(jīng)成為人類生命健康的重大威脅。非編碼RNA在許多人類疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，circRNA也順勢成為心血管疾病及相關(guān)機(jī)制研究的熱點[54]。目前circRNA與人類疾病相互關(guān)系的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域[55]，但也有越來越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用(表1)?，F(xiàn)階段多數(shù)研究仍停留在動物模型階段，但由于circRNA的保守性，動物模型與人類疾病很可能有相似的差異表達(dá)[56]。

4.1 circRNA與心肌病 心肌病是一組由于心室結(jié)構(gòu)變化和心肌功能障礙導(dǎo)致心臟功能進(jìn)行性下降的疾病，可分為肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病和限制型心肌病等。心肌病可有心臟擴(kuò)大、心律失常、血栓形成和心力衰竭等臨床表現(xiàn)，病因多認(rèn)為與病毒感染、免疫反應(yīng)、遺傳因素、藥物中毒和心肌代謝異常等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)circRNA在心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中有著特殊的作用[1]。

表1 心血管疾病中circRNA的差異表達(dá)Tab.1 Differential expression of circRNAs in cardiovascular diseases

有研究顯示，心臟相關(guān)的circRNA(heart-related circular RNA，HRCR)通過抑制miR-223活性，上調(diào)其靶基因編碼的具有含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with caspase recruitment domain，ARC)，對心臟肥大和心力衰竭的發(fā)生起保護(hù)性作用[74-75]，首次證實了circRNA參與心臟生理或病理過程的調(diào)節(jié)。

然而，更多研究者認(rèn)為心肌細(xì)胞中circRNA常表現(xiàn)為一種負(fù)性調(diào)節(jié)的因素，其含量升高多提示心肌細(xì)胞生理功能的下降甚至死亡。有報道稱在擴(kuò)張型心肌病中RNA結(jié)合motif蛋白20(RNA binding motif protein，RBM20)依賴性的circRNA有差異表達(dá)[27]。慢性酒精性心肌病模型小鼠的心肌組織中發(fā)現(xiàn)多達(dá)265種circRNA的差異表達(dá)，多數(shù)與糖代謝紊亂有關(guān)[76]。

circRNA與心肌纖維化也有關(guān)系。心臟纖維化的特征在于細(xì)胞外基質(zhì)的過度積累，導(dǎo)致正常心臟結(jié)構(gòu)的損害和進(jìn)行性心臟功能障礙[77]。circFoxo3可以阻止轉(zhuǎn)錄因子ID1、E2F1、FAK和HIF1α轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，從而抑制細(xì)胞的抗纖維化能力[78]。在用血管緊張素Ⅱ處理的糖尿病小鼠心肌細(xì)胞中，circRNA_000203和circRNA_010567的水平增高，二者可下調(diào)miR-26b-5p和miR-141，上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)基因的表達(dá)，繼而導(dǎo)致心肌組織的相關(guān)蛋白質(zhì)如膠原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ，Col Ⅰ)、膠原蛋白Ⅲ(CollagenⅢ，Col Ⅲ)和α-平滑肌肌動蛋白(smooth muscle α-actin，α-SMA)的纖維化[66-67]。雖然人們對于circRNA與心肌纖維化之間的關(guān)系有了一定程度的認(rèn)識，但均建立在體外實驗基礎(chǔ)上。因此，circRNA在心臟纖維化中的體內(nèi)功能及其在心肌成纖維細(xì)胞分化中的作用有待進(jìn)一步研究[79]。

4.2 circRNA與心肌梗死 circRNA在心肌梗死過程中也扮演著重要角色。心肌梗死是由于冠狀動脈閉塞、血流中斷，使相應(yīng)灌注區(qū)域心肌因長時間缺血、缺氧而發(fā)生壞死的過程。因此，心肌梗死患者?？沙霈F(xiàn)心功能不全、心律失常等并發(fā)癥。circRNA Cdr1as是miR-7a“海綿”，在心肌梗死引起缺血時可抑制miR-7a表達(dá)，使其靶mRNA編碼的刺激蛋白1(stimulatory protein 1，SP1)和多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)翻譯上調(diào)，加強(qiáng)對心肌的保護(hù)作用[33]。circRNA MFACR通過miRNA海綿作用抑制細(xì)胞質(zhì)中的miR-652-3p，增強(qiáng)線粒體蛋白18(mitochondrial protein 18kD，MTP18)的翻譯來促進(jìn)線粒體分裂和心肌細(xì)胞死亡[80]，推測其可能是梗死后心肌細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制和治療靶點。研究者檢測了急性心肌梗死患者發(fā)病后3～4個月的血液樣本，發(fā)現(xiàn)circRNA MICRA在心功能不全組(射血分?jǐn)?shù)＜40%)的表達(dá)量高于心功能正常組(射血分?jǐn)?shù)≥40%)，認(rèn)為MICRA可用于急性心肌梗死的危險程度分級和心功能預(yù)后的早期判斷[81]。對心肌梗死后心功能不全小鼠的左室心肌進(jìn)行芯片檢測結(jié)果提示，多種circRNA可主動響應(yīng)應(yīng)激，可作為心肌梗死后心功能不全的標(biāo)志物[63]。對于尚未進(jìn)展至心肌梗死的冠心病患者，有報道稱circ_0124644在外周血中水平升高，可作為冠心病的潛在生物標(biāo)志物[82]。另外，circRNA_081881在心肌梗死患者血漿中明顯下降，而且它有7個miR-548的結(jié)合位點，據(jù)推測其可通過調(diào)節(jié)miR-548的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)的合成，并對多種細(xì)胞代謝具有調(diào)節(jié)功能[83]。

4.3 circRNA與高血壓病 高血壓病主要表現(xiàn)為體循環(huán)動脈血壓升高，可伴有心、腦、腎等器官損害。高血壓病是最常見的慢性病之一，也是心血管疾病最重要的危險因素。在高血壓病患者中90%以上病因不明確，稱原發(fā)性高血壓病。circRNA是否與高血壓病存在內(nèi)在聯(lián)系是值得深入思考的問題。

血管通過血管平滑肌的收縮和舒張維持血壓的穩(wěn)態(tài)，而血管平滑肌的功能依賴于多種蛋白質(zhì)如α-SMA等。研究發(fā)現(xiàn)，circActa2可發(fā)揮miR-548f-59海綿功能，降低后者在血管平滑肌細(xì)胞中的水平，從而調(diào)節(jié)miR-548f-59對α-SMA mRNA的降解，增加α-SMA蛋白翻譯并增強(qiáng)蛋白收縮能力，提示circActa2/miR-548f-59/α-SMA途徑可能是原發(fā)性高血壓的潛在分子機(jī)制[84]。另有一項納入200例患者的病例對照研究發(fā)現(xiàn)，circ_0037911通過調(diào)節(jié)血肌酐水平促進(jìn)原發(fā)性高血壓病的發(fā)生和發(fā)展，并可作為原發(fā)性高血壓病潛在的生物標(biāo)志物[85]。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓病患者的血漿樣本中circ_0005870水平明顯升高，并通過下調(diào)miR-619、miR-1273g、miR-5095、miR-5096、miR-6807的表達(dá)，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能，可作為高血壓病診斷的全新生物標(biāo)志物[58]。

肺動脈高壓癥也有相似的circRNA生物標(biāo)志物。如近年來有報道稱，circ_0002062和circ_0022342可作為肺動脈高壓癥的生物標(biāo)志物[59]。對肺動脈高壓小鼠的肺組織進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，circ_004592和circ_018351參考調(diào)控肺動脈高壓的形成過程，可作為肺動脈高壓癥的潛在標(biāo)志物和藥物治療靶點[60]。

4.4 circRNA與動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化是由動脈壁內(nèi)皮下層的脂質(zhì)沉積引發(fā)的，其特征是巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和活化T細(xì)胞的炎性浸潤[86]。在冠狀動脈粥樣硬化中，多種circRNA被報告為潛在的生物標(biāo)志物，如存在于循環(huán)血中的多種circRNA[68,82]有利于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的篩查和早期診斷。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑4基因座中的反義非編碼RNA(antisense non-coding RNA in the inhibitors of cyclin dependent kinase 4 locus，ANRIL)對涉及前rRNA加工和核糖體合成的pescadillo同系物1(pescadillo homologue 1，PES1)有調(diào)節(jié)作用，而抑制血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中PES1的表達(dá)可引起核仁應(yīng)激和p53激活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[86]。利用注射維生素D3和喂食高脂飲食構(gòu)建的動脈粥樣硬化大鼠模型中，降低冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞中ANRIL的表達(dá)可減少細(xì)胞凋亡和炎癥因子的釋放，預(yù)防冠狀動脈粥樣硬化[87]。動脈粥樣硬化常累及含有平滑肌層的大、中動脈，引起這些動脈的管壁硬化、狹窄。前述circActa2/miR-548f-59/α-SMA途徑中circActa2水平升高可正向調(diào)節(jié)α-SMA的數(shù)量和收縮功能，進(jìn)而增強(qiáng)肌性動脈的收縮，導(dǎo)致高血壓病和動脈硬化[84]。有研究用氧化型低密度脂蛋白處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞制作血管粥樣硬化模型，發(fā)現(xiàn)沉默circ_0003575后增強(qiáng)了細(xì)胞增殖和血管生成能力，認(rèn)為circ_0003575升高可能是血管損傷后動脈發(fā)生粥樣硬化的關(guān)鍵[69]。

4.5 circRNA與心血管缺血再灌注損傷 由于壓迫、栓塞、痙攣等各種原因引起的組織缺血既影響相應(yīng)的灌流區(qū)域，又對血管本身的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷。在體外缺氧條件下，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中circRNA cZNF292受缺氧調(diào)節(jié)，其高表達(dá)可對內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧損傷起保護(hù)作用，但cZNF292不具有miRNA結(jié)合位點，并非通過miRNA海綿機(jī)制而發(fā)揮作用[62]。高血壓和冠狀動脈粥樣硬化患者的血漿中均可檢測到circRNA cZNF609的差異表達(dá)。應(yīng)用視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)研究circRNA在血管功能障礙中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cZNF609在體內(nèi)和體外低氧應(yīng)激下明顯上調(diào)；進(jìn)一步研究顯示，cZNF609沉默可增加內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和成管，對內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激和缺氧應(yīng)激都有保護(hù)作用，過表達(dá)反之，其機(jī)制是cZNF609充當(dāng)內(nèi)源性miR-615-5p海綿以抑制miR-615-5p的活性。因此通過人工干預(yù)減少cZNF609表達(dá)有望成為治療血管內(nèi)皮損傷后功能障礙的有效措施[88]。

4.6 circRNA與糖尿病血管病變 糖尿病是動脈粥樣硬化的獨立危險因素之一。在體外高糖環(huán)境培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到了1000多種新的circRNA和95種差異表達(dá)的circRNA，進(jìn)一步研究表明，這些差異表達(dá)的circRNA調(diào)控磷酸化蛋白、轉(zhuǎn)移酶和鋅指蛋白的翻譯，作為miRNA海綿調(diào)節(jié)糖代謝[73]，參與糖尿病血管病變。還有研究表明，高糖刺激下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中circHIPK3含量明顯上調(diào)，circHIPK3可充當(dāng)內(nèi)源性miR-30a-3p海綿，抑制miR-30a-3p的活性，并導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)、無翅型小鼠乳腺腫瘤病毒整合位點家族成員2(winglesstype mouse mammary tumor virusintegration site family member 2，WNT2)和配體卷曲-4(frizzled-4，F(xiàn)ZD4)蛋白的表達(dá)增加，提示circHIPK3通過阻斷miR-30a而引起血管內(nèi)皮增殖障礙[89]，參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。前述視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的實驗研究方法同樣適用于高糖刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默cZNF609同樣可減輕高糖環(huán)境造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[88]。

有研究表明，高糖環(huán)境下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中circ_0054633表達(dá)升高，而下調(diào)circRNA-0054633可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，包括增殖、遷移和血管生成能力；而生物信息學(xué)分析顯示，circRNA-0054633可能通過抑制miR-218的表達(dá)，降低其通過促進(jìn)環(huán)形交叉軸突導(dǎo)向受體同源物1(roundabout1，ROBO1)和血紅蛋白加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)的合成來抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，提示circRNA_0054633通過靶向ROBO1和HO-1而對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙發(fā)揮保護(hù)作用[90]。

4.7 circRNA與其他血管疾病 有研究對6例胸主動脈夾層患者的主動脈標(biāo)本進(jìn)行檢測，并結(jié)合生物信息學(xué)分析預(yù)測circRNA_101238可能的靶miRNA為miR-320a，同時發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)的表達(dá)上調(diào)，而三者之間具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確[70]。嬰幼兒血管瘤是最常見的嬰幼兒良性腫瘤之一。研究者在10名嬰兒不同部位的血管瘤標(biāo)本中檢測出的circRNA中有234個表達(dá)上調(diào)和374個表達(dá)下調(diào)，并鑒定了其中circRNA_100933的上調(diào)和circRNA_100709的下調(diào)，然后通過生物信息學(xué)分析分別構(gòu)建了含有100個和94個靶基因的circRNA/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)，GO分析顯示兩個網(wǎng)絡(luò)均參與了血管發(fā)生和發(fā)育過程[71]。

5 circRNA在心血管疾病中的作用研究現(xiàn)狀

circRNA是新興的研究熱點，但是在心血管疾病領(lǐng)域發(fā)表的文獻(xiàn)相對較少。據(jù)統(tǒng)計，目前Web of Science數(shù)據(jù)庫收錄的circRNA與心血管疾病相關(guān)的論文僅241篇，其中近5年發(fā)表了188篇，我國研究者貢獻(xiàn)了101篇文獻(xiàn)(圖2)，我國在該領(lǐng)域發(fā)表的文獻(xiàn)明顯多于其他國家(圖3)，說明我國是該研究領(lǐng)域的主要推動者。文獻(xiàn)質(zhì)量上，我國發(fā)表文獻(xiàn)的總引用頻次達(dá)1226次，平均引用12.14次，H指數(shù)(H-index)為17，即有17篇文獻(xiàn)至少被引用17次。H指數(shù)是由美國物理學(xué)家喬治·赫希(Jorge Hirsch)在2005年提出的，用以量化某研究者或某一地區(qū)的研究成果[91]。由于H指數(shù)摒棄了傳統(tǒng)的被引量，避免了自引等因素的影響，是用于評價文獻(xiàn)質(zhì)量的較客觀的指標(biāo)?？梢?，我國心血管疾病相關(guān)circRNA研究的數(shù)量和質(zhì)量都處于世界前列，有較好的研究基礎(chǔ)。但從整體上看，這一領(lǐng)域還有很大的探索空間，可以說circRNA與心血管疾病的相關(guān)研究才剛剛起步。

圖2 與心血管疾病相關(guān)的circRNA研究論文發(fā)表情況Fig.2 The publication of articles on circRNA related to cardiovascular diseases

圖3 各國發(fā)表的與心血管疾病相關(guān)的circRNA研究論文情況Fig.3 Articles on circRNA related to cardiovascular diseases published from different countries

6 總結(jié)與展望

有文獻(xiàn)報道，神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、糖尿病等多種疾病中circRNA的表達(dá)存在時空特異性，且具有一定功能，但其確切機(jī)制尚未完全明確[92-95]。其中，心血管疾病中也存在多種circRNA的差異表達(dá)，對circRNA及其功能的研究已成為當(dāng)前心血管疾病基礎(chǔ)研究的熱點之一[78]。多個研究報道，circRNA在動脈粥樣硬化[86]、心肌病[76]、心肌梗死[83]和高血壓病[85]的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。此外，對快速心房起搏動物模型的研究發(fā)現(xiàn)了4種circRNA在實驗組存在差異表達(dá)[96]，說明circRNA在房顫發(fā)病過程中也發(fā)揮著作用。但是circRNA與心律失常發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系未見更多報道，需要更多的研究繼續(xù)探索。另有報道稱circRNA-284可以作為頸動脈斑塊破裂的標(biāo)志物，原因是circRNA-284的靶miRNA(miR-221和miR-222)與頸動脈斑塊破裂密切相關(guān)[97]。顯然在頸動脈斑塊破裂潛在標(biāo)志物的尋找和驗證過程中，性質(zhì)穩(wěn)定的circRNA比miRNA更有優(yōu)勢。雖然當(dāng)前circRNA作為心血管疾病標(biāo)志物的相關(guān)報道還不多，但是circRNA-284的例子提供了一個思路，即是否可以嘗試從已知的可作為心血管疾病標(biāo)志物的miRNA入手尋找其上游circRNA作為新的標(biāo)志物。隨著越來越多的與心臟和血管相關(guān)的circRNA被發(fā)現(xiàn)，加之circRNA性質(zhì)穩(wěn)定，外周血circRNA的檢測有助于心血管疾病的診斷和預(yù)后判斷，而circRNA的調(diào)節(jié)是否能成為臨床治療新的突破口仍缺乏大規(guī)模臨床試驗數(shù)據(jù)的支撐[98]。而且，目前已知的許多circRNA被證實在體內(nèi)有多種功能，用它們作為疾病標(biāo)志物是否準(zhǔn)確和特異，仍值得商榷[99]。在心血管疾病相關(guān)的circRNA中，有許多被發(fā)現(xiàn)可以啟動蛋白質(zhì)的合成過程，但這一作用是否自然存在于人體內(nèi)仍是未知數(shù)[7]。

circRNA的臨床應(yīng)用仍有許多困難。其一，臨床上缺乏統(tǒng)一的從生物樣品中提取circRNA的方案。雖然實驗室已經(jīng)可以用多種方法分離、提純特定的circRNA，但是實驗試劑、檢測儀器的多樣性使其很難形成一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化提取方案供臨床檢測使用[1]。其二，circRNA在外周血中含量很少，難以用臨床常用的分光光度法進(jìn)行定量。如前文所述，circRNA定量方法優(yōu)選HTS和芯片檢測，而對于臨床上直接采集的樣品，可行的方法是使用靈敏度高的定量PCR(qPCR)法，但是qPCR法有其先天不足：正因其極高的靈敏度，臨床標(biāo)本中經(jīng)常會摻雜各種雜質(zhì)而使得qPCR定量的準(zhǔn)確性存疑[11]。

綜上所述，人工合成的circRNA可能的作用機(jī)制有：①對已知的致病miRNA進(jìn)行調(diào)控；②對已知有治療作用的線性RNA進(jìn)行環(huán)化以增強(qiáng)其抗RNA酶活性；③進(jìn)行蛋白質(zhì)或多肽翻譯，在體內(nèi)指導(dǎo)合成相應(yīng)的生物活性藥物；④通過作用于免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)免疫功能；⑤調(diào)控特定RBP活性；⑥直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄和剪接機(jī)制；⑦在體調(diào)節(jié)治療性circRNA表達(dá)等[56]。2012年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)lncRNA前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3)作為第一個非編碼生物標(biāo)志物用于臨床常規(guī)診斷前列腺癌[100]。因此，我們認(rèn)為，雖然circRNA仍有許多具體問題亟須解決，但是相信在不久的將來，人工合成circRNA作為一種藥物治療手段，一定有著廣闊的應(yīng)用前景。