細菌生物膜特征及治療的研究進展

王國旗，唐佩福

解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853

皮膚軟組織感染是世界性難題，一直備受關注，尤其是外科創(chuàng)傷所致的皮膚軟組織感染以及各種因素導致的慢性創(chuàng)面。而近20年來，細菌生物膜一直被認為是慢性感染形成及持續(xù)存在的關鍵因素[1-4]。因此，要想正確處理細菌感染，必須深刻認識細菌生物膜。本文對細菌生物膜特征、關鍵成分，以及現有的針對生物膜的相關治療進展進行綜述。

1 細菌生物膜的特征

細菌生物膜通常被定義為復雜菌落，其通過自分泌的方式產生大量的胞外多聚物(extracellular polymeric substances，EPS)[5-6]，這種顯型是細菌棲息的最佳狀態(tài)，與那些在實驗室里被廣泛研究的游離細菌有很大區(qū)別[7]。細菌生物膜的主要成分包括蛋白質、多糖、細胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)、水等。生物膜的形成是一個動態(tài)發(fā)展的過程，有研究發(fā)現細菌在創(chuàng)面24 h即可形成成熟的生物膜[8]。其形成大致分為3個階段：第一階段為定植期，也稱為黏附期，單個細菌或者少量細菌黏附在創(chuàng)面表面，此時細菌從可逆黏附發(fā)展為不可逆黏附，增殖并且產生大量的胞外基質，eDNA在此階段中起到重要的輔助作用[9]；第二階段為成熟期，此階段形成成熟穩(wěn)定且具有三維立體結構的生物膜；第三階段為播散期，此階段細菌在生物膜內隨時可以播散出去，重新再定植到其他部位。細菌生物膜可以黏附在生命體表面(如上皮細胞等)，也可以黏附在非生命體表面。如果是黏附在生命體表面，那么這個表面會存在蛋白或宿主細胞，這些都有可能改變細菌的黏附能力[10]。此外，細菌也可以不黏附在物體的表面而形成生物膜，如銅綠假單胞菌可以在呼吸道黏液內聚集形成生物膜[11]。

生物膜可以隱蔽在全身的所有部位，包括牙科陶瓷、鼻腔、泌尿道黏膜、心內膜、內鏡表面、骨科內置物以及外科創(chuàng)面，當其在組織中停留并且未引起免疫防御時即可形成純粹的共生關系[12]。之所以說生物膜是慢性感染形成及持續(xù)存在的關鍵因素，是因為成熟的生物膜不僅可以幫助細菌逃避機體先天性免疫和適應性免疫系統(tǒng)，還可以阻止外界抗菌物質進入，進而為細菌提供有利的環(huán)境[7-8]。近些年研究發(fā)現生物膜還具有耐藥性，生物膜對抗菌劑的耐受能力可能要比普通游離生物高出1 000倍[7]。而生物膜成分中的eDNA在耐藥中發(fā)揮了重要的作用。Chiang等[13]研究發(fā)現eDNA的保護作用可以讓銅綠假單胞菌對氨基糖苷類藥物產生耐藥性。Heidi等[14]發(fā)現eDNA具有抗菌活性，通過螯合陽離子使細胞裂解，而螯合陽離子可以穩(wěn)定細菌脂多糖和外膜。通過在生物膜形成過程中加入DNA溶解酶發(fā)現對于成熟的生物膜或銅綠假單胞菌的黏液型生物膜，DNA溶解酶不能發(fā)揮作用[15]。無論是革蘭陰性菌還是革蘭陽性菌，eDNA都是其生物膜基質的重要成分之一[16]。而在銅綠假單胞菌野生型菌株生物膜中，eDNA的產生與群體感應系統(tǒng)(quorum sensing，QS)有關，而QS系統(tǒng)的調控可以導致細胞的裂解進而為生物膜提供eDNA[13]。

2 生物膜的觀察

生物膜的觀察方法分為宏觀觀察和顯微鏡觀察。宏觀上，如果在創(chuàng)面上見到腐肉樣的物質，一般會認為有生物膜的存在。此外創(chuàng)面有光澤也可能是有生物膜存在。盡管這些宏觀的方法可以初步判斷生物膜的存在，但缺少明確的科學依據和標準，可信度并不高。

生物膜的微觀學主要依靠染色和顯微鏡。對創(chuàng)面細菌生物膜基質成分進行染色觀察是證實創(chuàng)面生物膜存在的方法之一，如刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)可以與銅綠假單胞菌胞外多糖特異性結合，采用熒光標記的ConA對組織標本進行染色，在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下即可觀察創(chuàng)面銅綠假單胞菌生物膜的存在[17-18]。肽核酸熒光原位雜 交(peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization，PNA-FISH)是一項可以對宿主組織內細菌進行精確定位的分子技術。該技術已經成功應用于慢性創(chuàng)面上不同細菌的區(qū)分與定位[19]。有研究采用FISH技術發(fā)現創(chuàng)面細菌多呈低密度或單菌落聚集狀態(tài)，在多重細菌感染的情況下也是如此[20]。此外，銅綠假單胞菌在創(chuàng)面上多傾向于獨立聚集成群[21]。而環(huán)境中的生物膜或共生生物膜則包含多種細菌，這種差異的原因目前尚不清楚。此外，掃描電鏡也是觀察細菌生物膜的重要方法之一。電子顯微鏡觀察發(fā)現慢性傷口較急性傷口更容易形成生物膜。一項慢性傷口和急性傷口的活檢觀察顯示，慢性傷口中60%有生物膜存在，而急性傷口中僅6%有生物膜存在[22]。在Li等[8]的兔耳金黃色葡萄球菌生物膜感染模型中，掃描電鏡可以清楚看到金黃色葡萄球菌在急性創(chuàng)面上聚集成葡萄串樣，周圍伴有大量細胞外基質成分。

3 生物膜的治療研究

對于治療生物膜感染創(chuàng)面，最經典也是最常用的方法為外科清創(chuàng)，可有效清除肉眼可見的壞死組織、活性較差的組織、可能存在生物膜的組織，且外科清創(chuàng)可有效清除大部分已存在的成熟生物膜。然而，外科清創(chuàng)并不能將創(chuàng)面生物膜徹底清除，因為創(chuàng)面組織是有限的，外科清創(chuàng)不可能為了清除生物膜而將全部組織清除，一旦生物膜有殘留，很快還會播散，再次形成新的生物膜，進而導致創(chuàng)面難以愈合[23]。

負壓創(chuàng)面療法(negative pressure wound therapy，NPWT)是近20年來國內應用較多的創(chuàng)面治療方法。2012年Ngo等[24]首先報道了體外負壓可以減少生物膜的厚度，降低生物膜的擴散距離。Phillips等[25]采用感染的豬皮生物膜作為研究對象，發(fā)現NPWT結合不同沖洗液可以有效的清除創(chuàng)面生物膜內的細菌。2016年Wang等[18]在體外研究中應用刀豆蛋白A染色，熒光顯微鏡觀察發(fā)現，與常壓環(huán)境相比負壓環(huán)境可以減少生物膜的形成量。在Li等[8]的NPWT治療兔耳生物膜感染模型中，金黃色葡萄球菌感染早期應用NPWT治療可以有效抑制生物膜的形成，但并不能清除已經成熟的生物膜。此外，在這個體外實驗部分中，作者發(fā)現負壓環(huán)境可以降低金黃色葡萄球菌生物膜中eDNA的總量。因為eDNA在細菌耐藥中發(fā)揮重要作用，提示負壓作用可能在降低細菌耐藥性方面發(fā)揮作用。但前尚缺少這方面的研究和直接證據。負壓創(chuàng)面療法結合沖洗(negative pressure wound therapy instillation，NPWTi)是對NPWT的改進，也是治療生物膜方法之一[26]。Phillips等[25]發(fā)現NPWT結合活性抗菌物質的沖洗可以加強NPWT對創(chuàng)面細菌清除的力度，可有效破壞細菌生物膜。

針對胞外聚合物(extracellular polymeric substance，EPS)的組成和結構進行治療是近年來興起的治療方法。胞外多糖降解酶就是典型代表，如葡萄糖水解酶(葡聚糖酶和非水溶性葡聚糖酶)、dispersin B可破壞口腔致病性生物膜的基質；糖苷水解酶類則被用來降解混合細菌(金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌)感染創(chuàng)面上形成的生物膜[27-29]。內溶菌酶(噬菌體編碼的肽聚糖水解酶)可以通過降解細菌細胞壁中的肽聚糖從而實現對生物膜中細菌的破壞[30]。經過工程化的肽聚糖水解酶可以與不同的抗菌物質結合，進而通過與肽聚糖的不同結合位點結合而實現裂解細菌，這種方法目前特異性地應用于金黃色葡萄球菌[31]，已經被證實可以有效殺滅細菌，清除生物膜。

脫氧核糖核酸酶(DNase)也是一種有效破壞生物膜的物質，無論在體內還是體外，采用DNaseⅠ均可以在早期有效破壞細菌生物膜，其機制是分解了生物膜中eDNA成分[32-33]。目前應用DNase專門針對體內生物膜的研究較少，但是體外研究證實其可以降低陰道加德納菌黏附陰道黏膜上皮細胞的能力[34]。

干擾細菌群體感應系統(tǒng)也是治療生物膜的方法之一。群體感應系統(tǒng)是細菌之間信息交流的重要渠道，很多細菌的毒力因子分泌都需要該系統(tǒng)。因此，QS系統(tǒng)中信號分子抑制劑在生物膜治療方面受到廣泛關注。如一項體外研究發(fā)現QS系統(tǒng)自引物(autoinducer)抑制劑可有效抑制細菌的黏附和播散[35]。Ⅰ型自誘導肽可以將聚集在鈦金屬表面的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌解散開，使耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對利福平和左氧氟沙星更加敏感[36]。最近一項研究使用苯甲酰胺-苯丙咪唑衍生物(M64)干擾銅綠假單胞菌喹諾酮信號系統(tǒng)，而該信號系統(tǒng)是調節(jié)生物膜形成和毒力因子產生的重要系統(tǒng)[37]。結果顯示，在小鼠的燒傷和肺部感染模型中M64降低了銅綠假單胞菌的毒力和毒性。當與環(huán)丙沙星聯合應用時還可以明顯降低細菌數量，而該實驗中未檢測到M64對巨噬細胞有毒性作用。

以抗菌肽為代表的肽類抗菌物質是治療生物膜的另一重要途徑。它的主要特點是保守性較高，對細菌和真菌的生物膜均有效[38-39]。正是基于此，可以采用人工合成的抗菌肽專門針對某一類細菌或真菌。如一項體外實驗發(fā)現該方法可以將金黃色葡萄球菌從口腔內多種細菌混合而成的生物膜中移除[40]?？咕念愡€具有靶向活性，可以針對休眠的細菌，這就使得細菌對其產生耐藥性的可能性降低。如果抗菌肽與抗生素聯合應用效果也會增加，在一個銅綠假單胞菌生物膜感染的無脊髓生物模型中，抗菌肽與抗生素聯合應用明顯增強了殺菌效果[41]。

此外，還有專門針對胞外基質的抗體以及核酸結合蛋白。有研究已經應用單克隆抗體針對銅綠假單胞菌來源的胞外基質中多聚糖成分，而在臨床提取的銅綠假單胞菌中可以產生這種多聚糖[42]。DNA結合蛋白的DNABⅡ家族可以破壞eDNA結構的完整性[43]。具有高親和性的整合宿主因子(integration host factor，IHF)可以特異性地與生物膜中的核酸蛋白結合，并且被廣泛應用于動物模型中[44-45]。

4 結語

隨著研究的進展，我們將更加深入地認識創(chuàng)面細菌生物膜，也會嘗試出更好的治療方法。無論是清創(chuàng)、負壓創(chuàng)面療法，還是針對胞外基質的各種降解酶、相關抗體以及結合蛋白，都是治療生物膜感染的潛在方案，它們可能在未來的生物膜治療領域發(fā)揮重要作用。

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