鐵皮石斛內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子制備及其可溶性糖含量測定

朱 波， 齊 川， 斯金平， 吳令上

(1.麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江麗水 323000； 2.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江臨安 311300；3.麗水市中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，浙江麗水 323000)

鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有益胃生津、滋陰清熱等功效，用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔等癥，位列中華九大仙草之首[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛含有多種藥效成分，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抑制心血管與胃腸道疾病及止痛退熱等作用[3-7]。植物內(nèi)生真菌(endophytic fungus)是指存在于健康植物根莖葉等組織內(nèi)部，不會對宿主植物造成明顯傷害或者引起宿主植物組織明顯病癥的真菌[8]。真菌誘導(dǎo)子是來源于真菌的一種特定化學(xué)信號，在植物與真菌的相互作用中，能引起植物細(xì)胞合成積累次生代謝物，對植物具有專一性，它們主要是真菌的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)或分泌物，可以是真菌菌絲體、滅活菌絲體、發(fā)酵液和分泌物等[9]。

目前，已有多名學(xué)者將從鐵皮石斛中分離得到的內(nèi)生真菌制備成誘導(dǎo)子，探討誘導(dǎo)子對宿主生長與成分代謝的影響。陳曉梅等將從鐵皮石斛中分離的小菇屬(Mycenasp.)真菌MF24液體發(fā)酵制備成誘導(dǎo)子，與宿主原球莖共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)子在早期可抑制原球莖生長，在后期可促進(jìn)原球莖生長，并能促進(jìn)原球莖中某些化學(xué)成分的產(chǎn)生或特異性積累，特別是對生物堿類成分尤為敏感[10-11]。宋經(jīng)元等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子可提高宿主原球莖多糖含量[12-13]。潘超美等研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)子對鐵皮石斛的愈傷組織、擬原球莖及不定芽均有不同程度的促生長作用，某些特定誘導(dǎo)子對根的分化有抑制作用[14]。侯丕勇等發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)子可促進(jìn)原球莖苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)和脂肪氧化酶(LOX)活性的升高[15]。但是，研究誘導(dǎo)子對宿主組培苗生長與代謝成分影響的報道尚不多見。前期研究顯示，鐵皮石斛內(nèi)生真菌DO14[擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)]、DO18[藍(lán)狀菌屬(Talaromycessp.)]、DO19[炭角菌科(Xylariaceae sp.)]、DO120[炭團(tuán)菌屬(Hypoxylonsp.)]可顯著促進(jìn)宿主生長與有效成分代謝[16]。為了探討內(nèi)生真菌起活性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究將上述優(yōu)良菌株制備成相應(yīng)誘導(dǎo)子，并進(jìn)行誘導(dǎo)子可溶性糖含量測定，為內(nèi)生真菌資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試內(nèi)生真菌DO14、DO18、DO19、DO120與鐵皮石斛組培苗均由浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室提供，詳見表1。

主要儀器：HVA-85全自動高壓蒸汽滅菌鍋(日本三洋電機(jī)株式會社)；SW-CJ-1C型雙人單面超凈工作臺(上?？德穬x器設(shè)備有限公司)；JZ-100-B型接種器具殺菌器(上海稼豐園藝用品有限公司)；Milli-Q Academic超純水儀(美國Millipore公司)；UV2550紫外-可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)；KQ5200DE型數(shù)控超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；MJP-250S型霉菌培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)；DGG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)；FA1004B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；HYG-A全溫?fù)u瓶柜(江蘇太倉實驗設(shè)備有限公司)。蒽酮乙酸乙酯試劑，取1 g分析純蒽酮(批號：30015014，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)溶于50 mL乙酸乙酯中，置于棕色瓶中保存；蔗糖(批號：40159760)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸(批號：81007)購自深圳市冠泰化工有限公司；水為超純水；其他試劑為分析純。

表1 供試內(nèi)生真菌

1.2 內(nèi)生真菌的固體培養(yǎng)與液體發(fā)酵

將目標(biāo)菌株從試管斜面挑出，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(含有200 g/L馬鈴薯、20 g/L葡萄糖、15 g/L瓊脂，pH值自然)上培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后，用真菌打孔器打成小菌塊(5 mm×5 mm)，接種至馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基(含有200 g/L馬鈴薯、20 g/L葡萄糖，pH值自然)中進(jìn)行發(fā)酵，每瓶接種10個菌塊，在 180 r/min、25 ℃條件下培養(yǎng)至一定階段，定期觀察菌液形態(tài)與顏色變化。

1.3 菌絲提取物(extract of mycelium，簡稱EM)誘導(dǎo)子的制備與可溶性糖含量的測定

將菌絲液體發(fā)酵液于121 ℃高溫滅菌20 min，用4層紗布過濾，收集菌絲，用無菌水洗滌3～5次，再用勻漿機(jī)打碎過濾，最后用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，即為EN誘導(dǎo)子溶液。將懸浮培養(yǎng)0、4、8、12、16、20 d的誘導(dǎo)子溶液，用蒽酮比色法[17]測定溶液中的可溶性糖含量，測定波長為620 nm，可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=8.717 1x+0.014 7，其中y代表D620 nm，x代表濃度，r2=0.999 8，線性范圍為0.005～0.05 mg/mL，試驗重復(fù)3次。

1.4 乙醇沉淀、上層清液、蛋白-多溏部位誘導(dǎo)子的制備

按照圖1方法分離EM誘導(dǎo)子化學(xué)部位，將誘導(dǎo)子溶液于 80 ℃ 減壓濃縮至一定體積，按體積比1 ∶4加入95%乙醇，于25 ℃沉淀2 d，8 000 r/min離心5 min，收集醇沉物，減壓凍干得乙醇沉淀(ethanol sediment，簡稱ES)粉末，上清液減壓凍干得上層清液(supernatant liquor，簡稱SL)粉末；將醇沉物ES溶于少量蒸餾水，加適當(dāng)體積Sevage試劑(三氯甲烷、正丁醇的體積比=5 ∶1)除蛋白，4 000 r/min離心5 min，取上清，通過截留分子量為2 ku的再生纖維素透析袋(長38 mm)用自來水透析48 h，用蒸餾水透析12 h，最后將透析袋內(nèi)液體濃縮減壓凍干得蛋白-多糖部位(protein polysaccharides fraction，簡稱PPF)粉末，主要包括多糖和與多糖結(jié)合的蛋白等成分[18]，分別計算DO14、DO18、DO19與DO120各誘導(dǎo)子得率，公式如下：各誘導(dǎo)子得率=誘導(dǎo)子粉末質(zhì)量/總菌絲質(zhì)量。試驗重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)子培養(yǎng)液形態(tài)觀察

將DO14、DO18、DO19與DO120菌株從PDA培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至PDB液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)后，菌絲塊形態(tài)與培養(yǎng)液顏色發(fā)生變化。DO14培養(yǎng)液為乳黃色，培養(yǎng)前期，菌絲塊周圍長出刺狀物，培養(yǎng)4 d時，菌絲塊與培養(yǎng)液呈混合凝膠狀，黏稠度較高，已無法分離菌塊，過濾較困難；DO18培養(yǎng)液為暗紅色，菌液較澄清，前期菌絲塊較集中，后期菌絲塊分散，容易過濾；DO19培養(yǎng)液為黑褐色，前期菌絲塊為黃色，培養(yǎng)1周后菌絲塊分散消失，肉眼不可見，菌液較渾濁，呈膠狀，黏稠度中等；DO120培養(yǎng)液為淡黃色，前期菌塊呈不規(guī)則形的較大顆粒狀，培養(yǎng)4 d時菌絲塊分散為細(xì)小顆粒，沉淀在底部，菌液澄清，過濾較容易。誘導(dǎo)子培養(yǎng)液形態(tài)觀察有助于掌握菌絲生長動態(tài)，便于后期誘導(dǎo)子菌絲的收集。

2.2 誘導(dǎo)子溶液可溶性糖含量動態(tài)變化

由圖2可見，DO14、DO18、DO19與DO120 EM誘導(dǎo)子溶液的可溶性糖含量隨著培養(yǎng)時間的延長而發(fā)生變化，在20 d培養(yǎng)期內(nèi)，以上4種供試菌株在培養(yǎng)4 d時可溶性糖含量最高，分別達(dá)到1.530、3.484、1.188、3.015 mg/mL，而后呈下降趨勢，其中培養(yǎng)4～8 d的區(qū)間下降趨勢最明顯，培養(yǎng)后期變化趨于平緩。從誘導(dǎo)子溶液可溶性糖含量看，培養(yǎng)4 d為目標(biāo)菌株最佳培養(yǎng)時間。

2.3 ES、SL與PPF誘導(dǎo)子得率比較

由表2可知，不同菌株ES、SL與PPF得率均存在顯著差異(P<0.05)，其中，DO120菌株ES、SL誘導(dǎo)子得率最高，分別達(dá)5.048 7、12.548 2 mg/g，DO14菌株P(guān)PF誘導(dǎo)子得率最高，達(dá)到0.840 7 mg/g。不同菌株誘導(dǎo)子的得率表現(xiàn)出差異，是內(nèi)生真菌菌絲生長速率差異、菌絲代謝產(chǎn)物多樣性的體現(xiàn)。根據(jù)不同誘導(dǎo)子得率，可制備目標(biāo)菌株特異性誘導(dǎo)子，進(jìn)而探討誘導(dǎo)子的最佳生物學(xué)活性。

表2 不同菌株ES、SL、PPF誘導(dǎo)子得率比較(n=3)

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母表示在0.05水平上存在顯著差異?！?”表示全區(qū)組間比較后在0.05水平有顯著差異。

3 結(jié)論與討論

某些活性較強(qiáng)的內(nèi)生真菌往往對植物存在一定的競爭性抑制作用，于是學(xué)者們將內(nèi)生真菌制備成各種誘導(dǎo)子來研究其對植物生長與成分代謝的影響。結(jié)果表明，內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子也可以顯著影響植物的生長與成分代謝[19]。Wang等從紅豆杉(Taxuschinensis)樹皮中分離得到1株內(nèi)生真菌黑曲霉(Aspergillusniger)，將其制備成誘導(dǎo)子溶液添加到紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞體系中，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子處理的紅豆杉紫杉醇含量提高了7倍，且誘導(dǎo)子濃度以碳水化合物總量計在40 mg/L時效果最好[20]。Zhao等將尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)Fat9菌株與鏈格孢屬(Alternariasp.)Fat15菌株制備成誘導(dǎo)子，添加到苦蕎麥(Fagopyrumtataricum)毛狀根培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子溶液能顯著提高苦蕎麥毛狀根蕓香苷含量，且以多糖含量計Fat9、Fat15誘導(dǎo)子在濃度為200 mg/L時作用效果最好，蕓香苷含量分別達(dá)45.9、47.2 mg/L，分別是對照的 3.1、3.2倍[21]。Ming等在研究深綠木霉促進(jìn)丹參酮生物合成的分子機(jī)制的過程中，發(fā)現(xiàn)深綠木霉菌絲水溶性提取物中的蛋白-多糖部位(PSF)能夠顯著提高丹參酮生物合成途徑中4種關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)丹參毛狀根中丹參酮類成分的生物合成，且促進(jìn)效果明顯好于上清液部位(SF)，同時，PSF誘導(dǎo)子以可溶性糖含量計在濃度為300 mg/L時的作用效果顯著好于濃度為40、150 mg/L時的[22]。因此可見，誘導(dǎo)子可溶性糖濃度、化學(xué)部位、培養(yǎng)時間等會顯著影響內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子生物學(xué)活性。

本研究首先觀察了DO14、DO18、DO19與DO120在培養(yǎng)不同階段菌絲與發(fā)酵液的形態(tài)特征，并以可溶性糖含量為指標(biāo)，探討了不同培養(yǎng)時間EM誘導(dǎo)子溶液可溶性糖含量變化規(guī)律。結(jié)果表明，培養(yǎng)4 d時可溶性糖含量最高。以培養(yǎng)4 d的EM誘導(dǎo)子溶液為母液，用水提醇沉透析法分離成ES、SL與PPF 3個部位，根據(jù)不同部位的誘導(dǎo)子得率，可將ES、SL與PPF分別配制成不同濃度的誘導(dǎo)子加入鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)基中，探討誘導(dǎo)子對鐵皮石斛生長與有效成分含量積累的影響，從而為下一步誘導(dǎo)子生物學(xué)活性、物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究提供參考依據(jù)。