金屬離子及表面活性劑對土著菌產纖維素酶的影響

楊耀剛， 田瑞華

(內蒙古農業(yè)大學生命科學學院，內蒙古呼和浩特 010018)

纖維素是地球上極為豐富的生物聚合物，是生物質資源之一，它是由葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成的線性不分枝的同聚多糖，纖維素是植物除水分以外的主要成分，約占其干質量的30%～50%，是目前分布最廣且最多的天然碳水化合物[1]。

目前對纖維素有效的利用很少，其中一小部分用于紡織、造紙、建筑和飼料等，一部分用作生產燃料乙醇，大部分沒有被利用，而是被農民取粒后直接焚燒，嚴重影響環(huán)境。秸稈自然還田，即生物降解是處理和利用秸稈等木質纖維素最具前景的方法，主要利用微生物可分泌產生纖維素酶這一特點，經微生物自然分解，參加自然界碳素循環(huán)，是增加作物產量、提高土壤肥力的有效途徑[2]，但微生物受外界環(huán)境因素所致及自生可分泌的纖維素酶較少，且纖維素酶水解玉米秸稈的過程中，纖維素酶不可逆地吸附在木質素表面，使纖維素酶的活性降低，導致秸稈的分解速度變慢，這樣存在降低地溫、加重病蟲害、影響播種等問題[3-4]。為加快纖維素的酶解速度，在纖維素酶解過程中添加表面活性劑來阻止木質素對纖維素酶的無效吸附，添加纖維素酶的激活劑金屬離子來提高纖維素酶解的反應速度。

到目前為止，有很多與產纖維素酶生產菌的相關報道，如青霉、假單胞菌屬、木霉屬、曲霉屬以及構建的工程菌，這些研究都集中在工業(yè)酶的基礎上[5-6]，對于土壤自身土著菌微生物的研究甚少。在長期的生產實踐中發(fā)現，植物細胞壁成分的復雜性及不同細胞壁成分的差異導致分解纖維素微生物單獨作用下不能完成或只能微弱完成纖維素的降解，所以必須依靠2種及2種以上的微生物共同作用[7-8]。因此，本研究以玉米秸稈為原料，在不破壞原有土壤中降解纖維素菌群平衡的基礎上，通過植物生長所需的金屬離子及有利于土壤修復的表面活性劑對土著菌產酶條件優(yōu)化的研究[9-11]，找出能夠提高產酶效率的因子，制作成加速還田秸稈分解的菌劑，在秸稈還田時配施在土壤中，加快還田秸稈的有效降解，為提高土壤的肥力及增加農作物產量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土樣于2017年4月采自內蒙古自治區(qū)磴口縣巴彥高勒鎮(zhèn)周邊玉米地，樣品采集到無菌自封袋中，迅速壓實擠掉多余空氣，于4 ℃冰箱中保存；試驗用秸稈采自當地農戶家中，除去樣品中的雜質，截成長度8～10 cm，帶回實驗室，粉碎，常溫干燥環(huán)境條件下貯存，備用。

1.2 試驗試劑

pH值為6.5的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液、1%羧甲基纖維素鈉溶液、DNS試劑(配制)；硫酸鐵、硫酸亞鐵、硫酸鈉、硫酸鋅、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸錳、氯化鈣、氯化鈷、硫酸鉀，十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)、Tween 20、Tween 80、PEG 2000、PEG 6000、PEG 8000為化學純。

1.3 土著菌的最適溫度、pH值、氮源

將采到的土樣各稱取10 g于廣口瓶中，加入已滅菌 490 mL 水、5 g秸稈粉、1 g微晶纖維素、1 g羧甲基纖維素鈉、3 g尿素、3 g濾紙條，放置于常溫，隔1 d搖晃1次，為1代菌。20 d后取50 mL 1代菌液，加入滅菌后的水450 mL、5 g秸稈粉、1 g微晶纖維素、1 g羧甲基纖維素鈉、3 g尿素、3 g濾紙條，放置于常溫，隔1 d搖晃1次，為2代菌，連續(xù)傳代到第10代。各取第9代菌液20 mL，加入已滅菌80 mL水、0.5 g秸稈粉、0.2 g微晶纖維素、0.3 g羧甲基纖維素鈉、0.1 g尿素、0.2 g濾紙條，于250 mL三角瓶中，2個平行，分別置于20、30、40、50 ℃，pH值為5、6、7、8，氮源尿素、硫酸銨、蛋白胨的恒溫搖床中，50 r/min，測定酶活。

1.4 葡萄糖標準曲線的制作

制備不同濃度的葡萄糖標準溶液，分別加入1 mL DNS(3，5-二硝基水楊酸)溶液，搖勻，沸水浴5 min，冷卻、定容到5 mL。在540 nm波長處測定其吸光度，以葡萄(mg/mL)為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標，繪制出葡萄糖標準曲線。

1.5 酶活的測定及計算方法

向比色管中加入0.5 mL、12 000 r/min離心后的上清，加入0.5 mL的1%羧甲基纖維素納(CMC-Na)溶液，混勻后50 ℃水浴 45 min，加入1 mL的DNS液，沸水浴5 min，立刻冷卻，加入 3 mL 蒸餾水，搖勻，取200 μL，540 nm波長下測定各溶液的D540 nm值。

纖維素酶活力定義：以CMC-Na為底物，在溫度為 50 ℃、pH值為6.3、恒溫45 min的條件下，以水解反應中 1 min 催化CMC-Na水解形成1 μmol葡萄糖的酶量為1個單位，用“U”表示。

1.6 不同金屬離子對土著菌產酶的影響

試驗考察植物在生長過程中所需的9種金屬離子對纖維素產酶的影響，在土著菌群水解玉米秸稈的同時分別添加各自不同濃度的金屬離子鹽溶液與菌液充分混合(表1)，發(fā)酵7 d，根據上述方法測定其纖維素酶活力。

表1 添加不同金屬離子的濃度梯度

1.7 不同表面活性劑對土著菌產酶的影響

向水解反應體系中加入不同濃度的6種表面活性劑，發(fā)酵7 d，根據上述方法測定表面活性劑在不同加入量下對土著菌產纖維素酶的影響。

表2 添加不同表面活性劑的濃度梯度

2 結果與分析

濾紙是結晶度和聚合度都居中等的纖維材料，濾紙酶活性即纖維素酶的總酶活力，以其為底物測濾紙崩解可用來表征纖維素酶的總糖化能力，因此對濾紙有良好降解效果的則具有較強的產纖維素酶能力[8，12]。故根據不同單因素下的濾紙崩解情況，確定土著菌的最適生長產酶溫度為30 ℃、pH值為偏酸性、氮源為蛋白胨，含量為0.2%。葡萄糖標準曲線方程為y=0.791 6x-0.087 6(r2=0.995 2)(圖1)。

2.1 不同金屬離子對土著菌產酶的影響

在纖維素酶合成過程中，Fe3+是許多酶的激活劑，由圖2可知，在發(fā)酵過程中，低濃度的Fe3+對土著纖維素菌劑產酶有促進作用，當Fe3+的濃度為0.3 mmol/L時，促進作用最強，此濃度下使纖維素酶合成水平有較大的提高。隨著Fe3+濃度的增加，對土著菌產酶幾乎沒有影響。

由圖3可知，低濃度的Na+能夠促進土著菌產纖維素酶，從而有利于對秸稈的水解，當Na+濃度為0.7 mmol/L時，其相對酶活達到最大值，為111 U，隨著溶液中Na+濃度的增加，對土著菌體的滲透壓增高，抑制菌的生長，產纖維素酶下降，因此由促進轉變?yōu)橐种啤?/p>

在土著菌生長過程中，圖4顯示低濃度的Zn2+作為營養(yǎng)離子能夠刺激土著菌加快完成生理代謝過程，有利于酶的合成，Zn2+的濃度為1.8 mmol/L時，酶活力達到最大值。當Zn2+的濃度高于1.8 mmol/L時，影響菌體對營養(yǎng)物質的吸收，不利于酶的合成，成為毒性離子，因此由促進作用變?yōu)橐种谱饔谩?/p>

圖5顯示，Ca2+濃度在0.0～0.1 mmol/L時，對纖維素酶活力呈激活作用，且激活作用逐漸增加，從0.1 mmol/L開始，激活作用開始下降。在濃度大于0.1 mmol/L時，Ca2+對纖維素酶的作用轉為抑制作用，抑制作用隨濃度增大而加強。

由圖6可知，Cu2+對纖維素酶活性整體呈激活作用，Cu2+濃度在0.0～0.9 mmol/L時，激活作用不顯著，Cu2+濃度在1.0 mmol/L以后，激活作用開始增加?？赡苁且驗镃u2+是構成漆酶不可缺少的金屬離子，銅作為漆酶活力中心的組成成分，參與漆酶蛋白的合成，在限銅或缺銅時，漆酶蛋白表達受限，所以活力較低。在秸稈的分解中，漆酶降解玉米秸稈中的木質素，使秸稈中的纖維素暴露出來，間接地有利于土著菌對纖維素酶的分泌。

Mn2+能夠參與細菌超氧化物歧化酶的活動，是錳過氧化物酶(MnP)、丙酮酸竣化酶、精氨酸酶等的輔助因子，也是腺嘌呤核苷酸酶和一些水解酶的激活劑，Mn2+對纖維素酶活力整體呈激活作用，Mn2+在濃度為0.3 mmol/L時，激活作用達到最大，以后開始減弱，但依舊表現為激活作用。

Co2+是微生物生長需要的具有特殊生物學功能的微量金屬元素，其與微生物之間存在著密切的相互作用，在給定的范圍內，對土著菌產酶具有促進作用。Co2+濃度為0.6 mmol/L時，其激活作用最強，隨著環(huán)境中Co2+濃度增高，會影響甚至抑制微生物的生長及代謝活動，其激活作用呈下降趨勢。

K+對土著菌產酶的影響與Na+相似，在低濃度是具有促進作用，當濃度為0.6 mmol/L時，其相對酶活達到最大值，隨著環(huán)境濃度的升高，在微生物體內形成Na-K泵，影響土著菌的滲透壓，因此變?yōu)橐种谱饔谩?/p>

水解纖維素酶是蛋白質，物理、化學、生物等因子都能影響蛋白質空間結構的改變，金屬離子對酶的催化作用尤其重要，金屬離子主要通過影響底物反應定向或可逆改變金屬離子的氧化態(tài)來調節(jié)氧化還原反應等途徑參加催化過程[13]。國內外對此進行了研究，其結論有所不同，研究結果表明，金屬離子對纖維素酶的影響除了金屬離子本身以外，還與反應的條件及環(huán)境有關，在一定的濃度下有的表現為激活作用，有的則相反，何林富等在金屬對林芝纖維素酶活力的研究中發(fā)現，K+、Zn2+對纖維素酶活有促進作用，Cu2+、Mn2+則對靈芝纖維素酶活有抑制作用[14]。王娜娜等在金屬離子對纖維素酶水解玉米秸稈中研究發(fā)現，Ca2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+在一定的濃度范圍內對纖維素酶有不同程度的促進作用[15]。安剛等研究金屬離子對白蟻纖維素酶活力的影響發(fā)現，Na+、K+對酶活沒有影響，Ca2+、Mn2+、Zn2+有激活作用，Cu2+有抑制作用[16]。李德瑩等在金屬離子對纖維素酶活力影響的研究發(fā)現，Fe3+、Co2+對纖維素酶活性有激活作用，Cu2+、Zn2+、Mn2+對纖維素酶活性有抑制作用[6]。李文歡等研究認為，Co2+、Mn2+對纖維素酶有激活作用，Cu2+、Ca2+對纖維素酶具有不同程度的抑制作用[17]。Ferchark等研究了金屬離子對纖維素酶活的影響，結果表明，Ca2+對纖維素酶活也有輕微的激活作用[18]。王聞等研究認為，Ca2+、Mn2+、Co2+在一定濃度范圍內對纖維素酶有激活作用，但效果不明顯[19]。李金寶等認為，Fe3+、Cu2+、Co2+能夠促進纖維素酶對纖維素的水解[20]。

2.2 不同表面活性劑對土著菌產酶的影響

表面活性劑能起到良好的增溶和乳化作用，可以降低纖維素及所處溶液的表面張力，使纖維素酶在整個反應體系中分散得更均勻，提高纖維素這種高分子聚合物的親水性，并促進底物與纖維素酶結合，提高酶的降解效率[21-22]。

圖7所示，添加非離子表面活性劑Tween 20、Tween 80時，對土著菌分解纖維素產糖在設定的范圍內低濃度時有輕微的促進作用，Kim等研究發(fā)現，0.5% Tween 80能夠使纖維素和濾紙的轉化率分別提高21.9%、23.0%[23]。Tween可以增加底物與酶的有效結合，提高纖維素酶的熱穩(wěn)定性，且Tween 20強于Tween 80，隨著添加濃度的增加，由輕微的促進作用變?yōu)橐种谱饔?，這與Kaar等研究結果[24-25]類似。

添加不同分子量大小非離子表面活性劑PEG時，在設定的范圍內對土著菌分解纖維素產糖低濃度有促進作用，其中PEG 6000提高幅度最大(圖8)。Qing等對作用機制進行了研究[26]；Kristensen等在秸稈的水解中加入PEG，同樣得到PEG 6000對秸稈水解的影響最大[27]。李鑫等在水解玉米秸稈中報道，PEG 6000減少纖維素酶的非生產性吸附，改善纖維素酶對玉米秸桿的水解性能效果最好[28]；席琳喬等在探究不同分子量大小PEG對棉稈木質纖維素酶解的影響中發(fā)現，同樣得到PEG 6000可以提高纖維素的轉化率[29]。

添加離子表面活性劑SDS，在設定的濃度范圍內有明顯的促進作用，當加入SDS加入量為6.85 mmol/L時，效果最好，相對酶活為169 U(圖9)。王娜娜等同樣發(fā)現，SDS對纖維素酶水解玉米秸稈有促進作用[15]。

金屬離子與表面活性劑對土著菌產纖維素酶的試驗結果與其他學者研究結果不盡相同，可能主要有2個原因：一是不同微生物源所產生的纖維素酶結構上有差別；二是不同的研究者所設定的金屬離子及表面活性劑濃度不同。

3 結論

通過試驗初步探索土著菌生長產酶的最適環(huán)境，混菌的產酶最適pH值為偏酸性，溫度為30 ℃，最適產酶的氮源為蛋白胨，其含量為0.2%。本研究只在單因素水平上探索不同的金屬離子與表面活性劑對土著纖維素菌產酶的影響，試驗結果表明，金屬離子與表面活性劑在一定的濃度范圍內對秸稈的水解具有促進作用，可以提高土著纖維素菌劑對秸稈的有效降解速度，在玉米秸稈還田時配施菌劑，從而提高土壤的肥力，增加農作物產量。然而金屬離子復配對纖維素菌產酶的研究較少，只有李文歡等研究2種金屬離子的復配，結果表明，比單獨添加1種金屬離子效果好[17]。因此，金屬離子復配以及金屬離子與表面活性劑相結合對纖維素菌產酶的影響有待不斷地深入研究。