順鉑誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡中鈣離子作用研究進展

張岳培,孫 偉,馮 靜,黃藝錦,徐徑舟,于 洋

(吉林醫(yī)藥學院:1.公共衛(wèi)生學院，2.臨床醫(yī)學院，3.科研實驗室，吉林 吉林 132013)

順鉑作為一種鉑類化合物，是臨床廣泛應(yīng)用于治療實體瘤最有效的化療藥物之一。以往的研究顯示順鉑的主要靶點是細胞核內(nèi)的DNA，可以抑制DNA的復(fù)制。最新的研究表明順鉑不僅可以發(fā)揮DNA依賴的效應(yīng)，也可以聚集在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器發(fā)揮非DNA依賴的效應(yīng)[1-3]。鈣離子作為細胞內(nèi)重要的第二信使，與細胞增殖、編程性死亡、肌肉刺激收縮、基因轉(zhuǎn)錄、信號傳遞等密切相關(guān)。而細胞內(nèi)鈣離子水平依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子釋放和來自細胞外空間的鈣離子流入。在正常情況下鈣離子促進細胞存活，但在順鉑刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放增加，鈣離子失衡誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)依賴和線粒體相關(guān)的凋亡[4-5]。本文對鈣離子在順鉑誘導(dǎo)腫瘤細胞氧化應(yīng)激、自噬、凋亡過程中發(fā)揮的信號作用及相關(guān)機制的研究進行總結(jié)，為提高順鉑化療腫瘤療效提供參考。

1 鈣離子和氧化應(yīng)激

正常情況下機體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，所以對機體并無有害影響。而多種外源性或內(nèi)源性有害刺激可打破這種平衡，致ROS大量生成而超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，機體就會形成氧化應(yīng)激狀態(tài)[6]。有研究表明順鉑不僅可以誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，還可以破壞細胞內(nèi)的鈣離子平衡[7-8]。

線粒體是決定細胞生存和死亡的關(guān)鍵因素，其在轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴大死亡信號的過程中起著十分重要的作用。在凋亡的內(nèi)源性途徑中，線粒體的功能是作為凋亡途徑的上游與胱天蛋白酶(caspas)、下游與死亡執(zhí)行器之間的連接[9-10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子和線粒體產(chǎn)生的ROS相互作用，一方面鈣離子可以增加ROS的產(chǎn)生，另一方面ROS可以影響鈣離子涌入細胞和鈣庫[11]。大量的ROS會損傷細胞內(nèi)的大分子，損傷線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，進而加劇順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷，觸發(fā)線粒體依賴的凋亡途徑。此外，通過抑制鈣離子流入胞漿和進入線粒體，導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS減少，降低腫瘤細胞凋亡率[12-13]。在順鉑或ATP激動劑誘導(dǎo)下，與順鉑耐藥細胞不同，卵巢癌skov3細胞胞漿中的鈣離子水平更有效地增加。一旦胞漿中鈣離子增加，就會影響線粒體中的鈣離子水平，線粒體的鈣離子過載觸發(fā)線粒體依賴的凋亡途徑[14]。

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是一種合成NO的關(guān)鍵酶，通過產(chǎn)生NO提高細胞內(nèi)氧化水平[15]。鈣離子和iNOS在細胞內(nèi)關(guān)系密切。在肝細胞中，鈣離子通過鈣調(diào)蛋白依賴的激酶，降低了細胞因子介導(dǎo)的iNOS的表達[16]。細胞因子通過改變細胞內(nèi)鈣離子濃度，來誘導(dǎo)肝細胞中iNOS的表達。而鈣離子信號通過下游許多蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控細胞內(nèi)基因表達，進而來調(diào)控iNOS表達。iNOS作為鈣離子的下游分子，還可以通過抑制參與順鉑誘導(dǎo)損傷的修復(fù)酶和提升細胞內(nèi)順鉑的積累來提高順鉑毒性作用。研究表明，通過鈣離子-iNOS通路提高了卵巢癌細胞的凋亡水平，降低了耐受性[15-17]。可見在順鉑誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡下，鈣離子調(diào)控氧化水平，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。

2 鈣離子和自噬

自噬的主要生理功能是吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器并將其包裹進囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，最終維持細胞穩(wěn)態(tài)。在缺氧、缺乏營養(yǎng)、感染等情況下，引起自噬，來對抗刺激，使自身存活。但持續(xù)的刺激也會引起細胞死亡。順鉑誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡中，可以伴隨自噬發(fā)生，而鈣離子參與其中自噬的調(diào)控。

在哺乳動物細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的儲存和釋放主要取決于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵對鈣離子的攝取，和肌醇三磷酸受體(inositol triphosphate receptor,IP3R)、雷諾定受體對鈣離子的釋放。有研究發(fā)現(xiàn)鈣離子和自噬聯(lián)系密切，鈣離子對自噬發(fā)揮雙向作用[18-19]。

2.1 鈣離子誘導(dǎo)自噬

順鉑誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡中鈣離子可以誘導(dǎo)自噬的途徑：①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣離子通過與細胞外信號調(diào)解激酶結(jié)合，使B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)蛋白磷酸化，進而Beclin1從Beclin1-BCL-2復(fù)合體上脫離，導(dǎo)致自噬的發(fā)生[20]；②鈣離子活化死亡相關(guān)蛋白激酶(death-associated protein kinase，DAPK)，活化后的DAPK磷酸化Beclin1的BH3-ONLY域，進而介導(dǎo)Beclin1分離，發(fā)生自噬[21]；③蛋白激酶Cθ被證實以鈣離子依賴模式參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性的自噬調(diào)節(jié)[22]；④鈣離子使鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶β活化，進而結(jié)節(jié)性硬化癥蛋白1/結(jié)節(jié)性硬化癥蛋白2磷酸化，再通過關(guān)閉Ras蛋白腦組織同源類似物，抑制雷帕霉素靶蛋白，誘導(dǎo)自噬[23-25]；⑤Bax抑制劑BI-1通過抑制Bax，降低鈣離子水平，影響線粒體功能，誘導(dǎo)自噬[26]。

2.2 鈣離子抑制自噬

鈣離子抑制自噬的途徑:①P3R介導(dǎo)的鈣離子降低Beclin1從BCL-2上釋放，自噬體生成減少，自噬水平降低[27]；②P3R介導(dǎo)的鈣離子，活化鈣蛋白酶，使自噬相關(guān)基因-5(autophagy related gene-5,ATG5)蛋白與ATG12蛋白分離，降低ATG5-ATG12復(fù)合體水平，降低自噬[28]；③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到線粒體的鈣離子增多，使三羧酸循環(huán)增加，ATP產(chǎn)生增多，進而抑制自噬[29]；④P3R介導(dǎo)鈣離子進入線粒體，導(dǎo)致ATP生成增加，AMPK被抑制，從而抑制自噬[29]。

鈣離子抑制順鉑誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬研究較少。由于自噬具有保護或促死作用，腫瘤細胞最終命運不同。已有研究表明，順鉑誘導(dǎo)宮頸癌海拉細胞發(fā)生自噬時，鈣離子水平增加，聯(lián)合鈣離子釋放抑制劑給藥，降低胞漿和線粒體中鈣離子水平，從而降低腫瘤細胞自噬，提高腫瘤細胞對順鉑的敏感性，腫瘤細胞生存率下降[30]?？梢娂毎|(zhì)內(nèi)鈣離子能增強順鉑誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)，而調(diào)控的自噬對于腫瘤來說起保護作用。順鉑誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬反應(yīng)，并伴隨著細胞質(zhì)中鈣離子濃度上升，絡(luò)合細胞質(zhì)中鈣離子，增強其下游自噬的反應(yīng)強度，說明細胞質(zhì)中的鈣離子對自噬具有抑制作用[31]?？梢娫诨熕幬镒饔孟?，鈣離子對自噬起著重要調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致腫瘤細胞對化療藥物敏感性改變。由于鈣離子與自噬聯(lián)系復(fù)雜，腫瘤細胞種類不同，技術(shù)限制或鈣離子刺激強弱，刺激時間等原因，鈣離子與自噬在順鉑作用腫瘤細胞中具體機制仍需進一步研究。

3 鈣離子和凋亡

細胞凋亡是一種高度保守的程序性死亡過程。順鉑是一種有效調(diào)節(jié)鈣離子濃度的化療藥物。鈣離子濃度、位置等的改變必然影響腫瘤細胞的命運。近些年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，順鉑發(fā)揮抗腫瘤作用與交叉對話的細胞器有關(guān)，尤其是線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間，其中典型的信號就是鈣離子[32]。

3.1 線粒體中的鈣離子和凋亡

生理狀況下，線粒體中鈣離子活化克雷布斯循環(huán)(krebs cycle)中的酶和刺激ATP生成。病理條件下，線粒體會增加線粒體中鈣離子的釋放，導(dǎo)致線粒體鈣超載，PTP開放和凋亡因子釋放(如細胞色素C)，誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡[33]。

通過研究發(fā)現(xiàn)，順鉑作用海拉細胞可以提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體鈣離子濃度，觸發(fā)線粒體調(diào)控和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)控的凋亡途徑。聯(lián)合鈣離子阻斷藥，可以降低順鉑的毒性作用。BCl-2家族蛋白是線粒體途徑凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，包括促凋亡蛋白(BAX、BAK)、抗凋亡蛋白(BCL-2)和BH-only蛋白(Bid、Bim、Bid)。其中BCL-2促凋亡家族的Bax和Bak，也可通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子，致使線粒體鈣超載，觸發(fā)凋亡[34-35]。BcL-2抑制劑ABT737或BcL-2 siRNA提高細胞質(zhì)和線粒體中順鉑誘導(dǎo)的鈣離子水平，增加線粒體介導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡水平[36]。順鉑誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激耐受，可降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡水平，減少胞漿中的鈣離子轉(zhuǎn)移到線粒體，維持線粒體正?；顒?，導(dǎo)致順鉑敏感性降低[5]。

3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣離子和凋亡

各種生理和病理情況下，包括缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子耗竭、氧化損傷、高脂飲食、低血糖等均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊的能力失衡，導(dǎo)致未折疊蛋白堆積，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。細胞通過未折疊蛋白反應(yīng)、自噬和蛋白酶體等途徑進行恢復(fù)，若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過度，則細胞死亡[34]。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可以提高細胞質(zhì)和線粒體中的鈣離子水平，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的和線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。通過鈣離子螯合劑BATA，下調(diào)鈣蛋白酶、caspas-3、caspas-4和CHOP(促凋亡轉(zhuǎn)錄因子)，降低順鉑誘導(dǎo)的凋亡水平[14]。順鉑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過mTOR和Beclin1途徑調(diào)控自噬，導(dǎo)致腫瘤細胞對順鉑敏感性下降。

3.3 MAM鈣離子和凋亡

近些年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，順鉑發(fā)揮抗腫瘤作用與交叉對話的細胞器有關(guān)。尤其是線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間，而其中典型的信號就是鈣離子。研究表明，ABT737或Bcl-2 siRNA增加細胞質(zhì)和線粒體中順鉑誘導(dǎo)的鈣離子水平，提高線粒體介導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡水平。此外，ABT737或BcL-2siRNA通過線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria-associated membranes,MAM)，導(dǎo)致順鉑誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸點增加，增加鈣離子的轉(zhuǎn)移，致使線粒體鈣離子超載，發(fā)生凋亡[36]。還有，對順鉑誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激耐受會抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡，進而緩和線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣失衡，維持細胞存活，導(dǎo)致順鉑耐受。其中還發(fā)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)MAM結(jié)構(gòu)改變，增強線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聯(lián)系，導(dǎo)致線粒體鈣超載，發(fā)生凋亡[5]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和MAM上的P53，通過與sarco/ER鈣離子-ATPase泵聯(lián)系，調(diào)控線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)交叉對話，誘導(dǎo)鈣離子依賴的凋亡[37]。

順鉑作為一種化療藥物，可以通過多種途徑對胞漿、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子濃度和位置產(chǎn)生重要影響，既而調(diào)控下游分子，參與腫瘤細胞死亡。而鈣離子在順鉑耐藥細胞株中相較于非耐藥細胞株濃度上升變化不明顯，則說明鈣離子也參與到了腫瘤細胞順鉑耐藥機制中，一定程度上降低了順鉑誘導(dǎo)的耐藥腫瘤細胞的死亡。綜上所述,重要細胞器或胞漿內(nèi)鈣離子濃度的失衡或位置變化對順鉑誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡具有重要意義。