布魯氏菌感染的固有免疫機制研究進展

王 敏，劉 鑫

(內(nèi)蒙古民族大學 醫(yī)學院 病原生物學與免疫學教研室， 內(nèi)蒙古 通遼 028041)

布魯菌屬(Brucella)是布魯氏菌病(一類人畜共患傳染病)的病原菌，有10個生物種[1]。本屬使人致病的有羊布魯菌(B.melitensis)、 牛布魯菌(B.abortus)、豬布魯菌(B.suis)和犬布魯菌(B.canis)，在中國流行的主要是羊布魯氏菌病，其次是牛布魯氏菌病。近年疫情發(fā)展迅速，僅2014年就報告57 222例，覆蓋中國所有省份[ 2]，對其預(yù)防和控制迫在眉睫。本文就國內(nèi)外對固有免疫系統(tǒng)抗布魯氏菌感染的實驗和臨床研究新進展進行綜述。以期對臨床診治和疫苗研制方面提供參考。

布魯氏菌是革蘭陰性兼性胞內(nèi)菌，可感染多種類型細胞并在細胞內(nèi)繁殖，如巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cell, DC)和非吞噬細胞。機體感染布魯菌后，以細胞免疫為主，病后機體產(chǎn)生的IgG 和IgM類抗體，可發(fā)揮免疫調(diào)理作用。并在布魯氏菌各種和生物型之間可出現(xiàn)交叉免疫。

固有免疫系統(tǒng)(innate immune system)被認為是抵御入侵病原體的第一道防線，通過固有免疫監(jiān)視系統(tǒng)檢測組織中細菌的存在。固有免疫系統(tǒng)主要由專職吞噬細胞中性粒細胞和巨噬細胞、DC和自然殺傷(nature killer,NK)細胞組成，通過模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識別病原相關(guān)模式分子(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)[3]， 伴有細胞因子和趨化因子的分泌，并活化補體系統(tǒng)發(fā)揮抗感染作用。而布魯氏菌一方面表面分子缺乏典型PAMPs活性，因此，固有免疫誘導(dǎo)效果很弱；另一方面，布魯氏菌對固有免疫機制具有調(diào)制作用，其主要途徑是抑制Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)、補體系統(tǒng)和吞噬細胞的作用[4]。

1 單核/巨噬細胞對布魯氏菌感染的應(yīng)答特點

1.1 布魯氏菌抑制細胞表面MHC-Ⅰ和Ⅱ分子表達

單核/巨噬細胞是重要的專職抗原提呈細胞，其表面MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ分子的表達影響T細胞對菌體抗原的識別與活化。牛布魯氏菌(B.abortus)能夠誘導(dǎo)CD8+T細胞應(yīng)答。但是，細菌仍能夠在宿主體內(nèi)長期存在。研究發(fā)現(xiàn)，牛布魯菌介導(dǎo)MHC-Ⅰ類分子滯留在高爾基體內(nèi)，進而抑制干擾素γ誘導(dǎo)MHC在人類單核細胞表面的表達，且抑制能力依賴細菌活性，并通過表皮生長因子受體和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(EGFR-ERK)信號通路來逃避免疫系統(tǒng)防御，促進慢性感染過程的發(fā)展[5]。牛布魯氏菌亦可抑制IFN-γ誘導(dǎo)的人類單核細胞表面MHC-Ⅱ 分子的表達，進而減少抗原的提呈，建立胞內(nèi)寄生并通過不同機制逃避CD4+T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。細菌不僅能夠減少單核細胞表面成熟MHC-Ⅱ類分子表達，也抑制恒定鏈(Ⅰa)的表達。細菌外膜蛋白19(omp19)可減少MHC-Ⅱ和反式作用子(CIITA)轉(zhuǎn)錄。此外，細菌及其脂蛋白通過刺激IL-6的分泌，誘導(dǎo)γ干擾素信號負調(diào)控MHC- Ⅱ基因轉(zhuǎn)錄，抑制細胞因子信號SOCS- 1和3，阻止T細胞的識別，有利于細菌在機體建立慢性感染狀態(tài)[6]。

1.2 布魯氏菌PAMPs對單核/巨噬細胞PRR的作用

巨噬細胞表面具有多種PRRs。主要包括甘露糖受體、清道夫受體和TLR等，介導(dǎo)對病原體的吞噬作用。布魯氏菌PAMPs(DNA、脂多糖和脂蛋白等)促進PRRs的激活，是有效清除布魯氏菌的重要步驟[7]。布魯氏菌DNA中基因外重復(fù)回文序列(repetitive extragenic palindrome squence,REPs)能夠通過TLR9刺激巨噬細胞，啟動TLR9/NF-κB TLR9/MAPK信號通路促進IFN-α的合成。通過體外培養(yǎng)的小鼠RAW264.7單核巨噬細胞株以及Wistar大鼠巨噬細胞均檢測到REPs誘導(dǎo)干擾素的合成，當用siRNA敲除巨噬細胞REPs，刺激TLR9后，IFN-γ合成減少[8]。在布氏桿菌病神經(jīng)功能損害研究中發(fā)現(xiàn)，當把小膠質(zhì)細胞(定居類巨噬細胞)和感染牛布魯氏菌神經(jīng)元共同培養(yǎng)可出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元死亡消失現(xiàn)象。神經(jīng)元死亡并非細胞凋亡，而是依賴于小膠質(zhì)細胞釋放一氧化氮(NO)，誘導(dǎo)的神經(jīng)元暴露PAMP—磷脂酰絲氨酸(PS，即“吃我”信號)。細菌感染刺激小膠質(zhì)細胞的增殖、吞噬活性增強并通過信號識別吞噬神經(jīng)細胞，這種現(xiàn)象依賴LPS對TLR2激活[9]。對PRR家族中NOD樣受體(nod like receptor,NLR)在布魯氏菌固有免疫應(yīng)答中的作用機制研究，發(fā)現(xiàn)NOD樣受體蛋白12(nod like receptor protein 12,NLRP12)可改變被感染巨噬細胞內(nèi)caspase-1活化和IL- 1β的分泌，NLRP12基因敲除小鼠感染后肝臟內(nèi)肉芽腫的數(shù)量和體積減小，IFN-γ 和IL- 1β合成增強，NLRP12在布魯氏菌感染過程中負向調(diào)節(jié)機體早期炎癥應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[10]。最新研究發(fā)現(xiàn),血小板活化因子受體(platelet-activating factor receptor，PAFR)是吞噬細胞對牛布魯氏菌吞噬機制的新型相關(guān)受體[11]，被感染巨噬細胞亦可誘導(dǎo)血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)的分泌，PAF 對PAFR刺激可誘導(dǎo)Janus激酶2(JAK2)和p38α磷酸化，顯著增加巨噬細胞攝取細菌。

2 樹突狀細胞(DC)對布魯氏菌感染的應(yīng)答特點

2.1 布魯氏菌抑制DC細胞的抗原提呈功能

DC是功能最強的抗原加工提呈細胞，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。DC表達多種PRR以及抗體Fc受體，可識別多種PAMP或抗原-抗體復(fù)合物(immune complex,IC)，通過胞飲、吞噬和/或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，攝取抗原物質(zhì)并清除之，執(zhí)行固有免疫應(yīng)答。2005年，首次闡明布魯氏菌可以侵入并在DC內(nèi)繁殖。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌不僅在人類DC還可以在牛和鼠類的DC內(nèi)繁殖。布魯氏菌可通過PI3激酶和TLR4受體進入DCs，進而在體內(nèi)或體外的DC內(nèi)有效地繁殖，并通過干擾素應(yīng)答路徑影響人類單核細胞來源的DCs的成熟[12]，抑制抗原提呈，導(dǎo)致初始T細胞的活化受阻；同時，被感染DC表面MHC-Ⅱ、CD80 和CD86分子表達下降，進而影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答誘導(dǎo)進程。

2.2 布魯氏菌PAMPs對DC細胞PRR的作用

用純化的牛布魯氏菌RNA 刺激并培養(yǎng)小鼠DC，上清液中通過ELISA檢測到大量IL- 12、IL- 6和γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10；進一步證明，IL- 12分泌依賴TLR7，而IL- 6的分泌依賴TLR7和部分依賴TLR3。而用牛布魯氏菌感染刺激方法發(fā)現(xiàn)，TLR7在誘導(dǎo)DCs分泌IL- 12發(fā)揮主要作用，從而認為，牛布魯氏菌RNA是一種重要的免疫調(diào)節(jié)核酸，其通過啟動TLR7和TLR3信號路徑影響鼠類DCs的細胞因子應(yīng)答和 Ⅰ 型 IFN的表達，進而發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[13]。而用種屬特異性模型(田鼠種布魯菌，該菌對小鼠有高致病性)，通過野生型和TLR基因(TLR2、TLR4、TLR9單基因和復(fù)合基因)敲除型田鼠復(fù)制感染模型，對DCs的成熟與促炎性細胞因子分泌進行分析發(fā)現(xiàn)，Tc細胞(來自TLR2×4-和4×TLR2×9-/-小鼠)抑制巨噬細胞內(nèi)細菌繁殖能力降低。提示，TLR2和TLR4參與特異性Tc細胞的生成。認為TLR2 和TLR4是通過影響DCs的成熟和特異性CD8+Tc細胞生成，調(diào)控抗田鼠布魯菌感染[14]。

3 中性粒細胞對布魯氏菌感染的應(yīng)答特點

布魯氏菌是一種可以隱蔽入侵固有免疫系統(tǒng)的病原體，很少激活中性粒細胞，卻能夠抵抗這些吞噬細胞的殺傷機制。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，布病患者靶器官中感染布魯氏菌的多形核細胞(polymorphoonuclear cells， PMNs)數(shù)量較少，患者血液中中性粒細胞呈現(xiàn)占比低的特點。LPS對中性粒細胞功能具有抑制作用。一旦牛布魯氏被中性粒細胞吞噬，LPS從含有病原菌的囊泡內(nèi)釋放出來后，可觸發(fā)一種新型非炎性細胞死亡，防止內(nèi)吞細菌被殺傷，并伴有低劑量促炎細胞因子CD14分泌，通過阻斷CD14分泌而不阻斷TLR4，可以阻止布魯氏菌LPS誘導(dǎo)的PMNs過早死亡[15]。

4 NK細胞對布魯氏菌感染的應(yīng)答特點

布魯氏菌通過誘導(dǎo)抗原加工提呈細胞釋放IL- 2活化NK細胞，活化后NK細胞具有殺傷功能，同時分泌IFN-γ；IFN-γ在啟動Th1 和 Tc1樣應(yīng)答中起著重要的作用。布魯氏菌感染過程中的一個突出特點是多克隆抗體的快速產(chǎn)生，特別是IgG2c亞類的產(chǎn)生。多克隆抗體產(chǎn)生過程中，B細胞的活化除了對克隆特異性抗原的特異性識別，還需要NK細胞的輔助(直接和細胞因子的放大作用)，NK細胞去除后，可顯著降低這些抗體的生成[16]。

5 其他固有免疫細胞應(yīng)答及細胞因子分泌特點

人類CD4+iNKT細胞(invariant NKT)具有抗豬布魯氏菌活性[17]，可以直接參與細菌清除，還通過殺傷侵染的巨噬細胞進而控制豬布魯氏菌的胞內(nèi)繁殖生長。其主要機制是iNKT細胞與巨噬細胞表面CD1d分子的相互作用，誘導(dǎo)Fas途徑和裂解顆粒的釋放，發(fā)揮細胞毒作用。

輔助性T細胞(Th)1型/2型細胞因子之間的平衡決定對布魯氏菌有抗性還是易感。通過分析細胞因子水平，可評估免疫系統(tǒng)在布魯氏菌感染及愈后中的作用。對急性期布魯氏菌病患者治療前后血清兩種細胞因子TGF-β和IL- 17，含量變化進行測定分析，結(jié)果，與健康對照組相比，患者血清中TGF-β含量顯著性降低，治療后期血清含量升高；而患者血清IL- 17 含量顯著性升高，治療后下降；但是，患者組兩種細胞因子治療前后變化統(tǒng)計學顯示無顯著性差異[18]。

6 結(jié)語與展望

布魯氏菌可多途徑感染機體，通過典型的胞內(nèi)寄生以隱秘的方式逃避或抑制固有免疫[19]，或通過誘變方式(指病原體通過改變自身的抗原特性)調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫，建立慢性、持續(xù)性感染。在感染的初期或急性期，機體能否及時控制布魯氏菌的復(fù)制，成功消滅其感染，固有免疫系統(tǒng)是關(guān)鍵所在[20]。目前，對于布魯氏菌的固有免疫研究多集中于對其主要寄生細胞，即巨噬細胞和DC的研究。這兩類細胞表面PRR的識別作用和DC亞群特異性應(yīng)答特點已成為近年的研究熱點。一些研究結(jié)果對于對布氏菌致病和免疫檢測具有積極意義，如篩選具有活化TLR9的牛種布氏菌REPs，并檢測其活性；采用乳脂肪球表皮生長因子8 蛋白(milk fat globule epidermal growth factor 8，MFG-E8)或其受體，可抑制小膠質(zhì)細胞的吞噬作用而不影響其活化，防止神經(jīng)元消失，為未來在治療布魯氏菌感染對神經(jīng)系統(tǒng)損害提供了一個新思路。另一方面，目前研究結(jié)果具有局限性，如多數(shù)數(shù)據(jù)來源于實驗動物，不同動物之間存在差異；實驗采用菌株多為牛種布魯氏菌，不能全面揭示其他常見流行菌種誘導(dǎo)易感動物或人類機體固有免疫的特征。因此，對布魯氏菌病的病原學及免疫學研究仍然是國內(nèi)外研究學者的長期課題。