人工感染細(xì)粒棘球蚴犬糞中蛋白質(zhì)組的分析

李雙男，閆鴻斌，李 立，姚 剛，田文俊，李文卉，張念章，吳燕濤，付寶權(quán), 2，賈萬忠, 2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省動物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

棘球蚴病俗稱包蟲病，是由細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)的中絳期(幼蟲)——細(xì)粒棘球蚴寄生于動物和人的肝、肺及其他器官而引起的一種呈世界性分布人獸共患病[1-4]。在中國，棘球蚴病主要流行于北方和西北地區(qū)，其中青藏高原為主要高發(fā)區(qū)之一；年人體手術(shù)病例2 000余例，流行區(qū)5 000萬人受到本病的嚴(yán)重威脅；患病家畜3 000萬頭(只)，年新發(fā)病例700萬頭(只)；年直接經(jīng)濟(jì)損失超過8億元[5-6]。棘球蚴病屬法定上報的傳染病，列為中國重點(diǎn)防控的寄生蟲病之一，已引起各級政府部門和研究機(jī)構(gòu)的高度重視。棘球蚴病對人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展都產(chǎn)生了嚴(yán)重的危害，它不僅是一個特殊的醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)問題，而且更是一個嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)問題。該病僅中南亞地區(qū)就有2.7億人遭受威脅，估計全球患者達(dá)300萬之多，每年診斷出的新增病例達(dá)20萬人，家畜感染數(shù)目達(dá)數(shù)千萬頭(只)，每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)19億美元[1，7-8]。細(xì)粒棘球絳蟲的成蟲以犬科動物為終末宿主，蟲卵可以隨著犬的糞便排出，人或羊等其他中間宿主吞食這些被污染過的污染物后蟲卵經(jīng)胃進(jìn)入十二指腸，六鉤蚴穿過腸壁，隨血液循環(huán)移行至肝、肺等器官，由此引起棘球蚴病。犬糞中蟲卵是該病傳播的一個關(guān)鍵要素，因此，對犬糞中細(xì)粒棘球絳蟲相關(guān)蛋白進(jìn)行研究，為建立糞抗原檢測方法提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而對防控棘球蚴病具有重大意義。本文利用以高分辨率的分離技術(shù)、質(zhì)譜鑒定技術(shù)以及生物信息學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究犬糞中細(xì)粒棘球絳蟲相關(guān)分泌蛋白，為宿主-寄生蟲相互作用和寄生蟲病的免疫病理學(xué)研究提供有價值的見解。到目前為止，已有7篇關(guān)于棘球絳蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究的報道，其中有5篇報道是針對細(xì)粒棘球絳蟲的。Chemale G等首次使用二維電泳分析細(xì)粒棘球蚴階段的蛋白質(zhì)成分，并獲得一定進(jìn)展[9-10]。細(xì)粒棘球蚴的分泌蛋白和排泄蛋白在宿主免疫應(yīng)答機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，這些蛋白被認(rèn)為是蛋白組學(xué)研究的主要內(nèi)容[11-15]。宿主中存在與包囊或原頭蚴相關(guān)的蛋白質(zhì)，這表明寄生蟲可能吸附于宿主表面?zhèn)窝b抗原，奪取營養(yǎng)，影響宿主的免疫應(yīng)答[10,13]。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究揭示了棘球絳蟲的抗原特性和免疫特性，然而，對細(xì)粒棘球絳蟲從感染終末宿主到成熟排卵時期蛋白的動態(tài)變化尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究中，通過人工感染細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，收集感染后不同時間的犬糞樣品，進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和質(zhì)譜分析，試圖闡明不同時間細(xì)粒棘球絳蟲的蛋白分泌變化和功能，從分子生物學(xué)角度為細(xì)粒棘球絳蟲感染的早期診斷奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料 試驗(yàn)中所涉及到的犬只均來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動物飼養(yǎng)場；所涉及到的細(xì)粒棘球蚴來自于西寧動物屠宰場采樣，病羊肝臟抽取，經(jīng)顯微鏡下確認(rèn)蟲體形態(tài)。

1.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 硫酸鈦、考馬斯亮蘭G-250、硫脲、Tris 堿、3-3-(膽酰胺丙基)二甲氨基丙磺酸內(nèi)鹽、二硫蘇糖醇等，Amresco公司產(chǎn)品；GTP(固定鈦離子親和色譜材料)，中國科學(xué)院大連化物所產(chǎn)品；碘乙酰胺，Merk 公司產(chǎn)品；尿素，Solarbio公司產(chǎn)品；Trypsin酶，Promega公司產(chǎn)品；zip-tip，Millipore公司產(chǎn)品；ACN(乙腈)，F(xiàn)isher公司產(chǎn)品；丙酮和三氟乙酸，Baker公司產(chǎn)品；甲酸，MREDA Technology公司產(chǎn)品。所有試劑都是分析純或者更高級別。Q Executive質(zhì)譜儀，UAS Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；LC-20AD納升液相色譜儀，島津公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物感染與糞便處理 試驗(yàn)前對犬進(jìn)行驅(qū)蟲，取糞便進(jìn)行PCR和ELISA[16-17]鑒定，確保選用的動物均無細(xì)粒棘球絳蟲感染。犬喂飼20 000個細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，分別在感染前和感染后16、21、25、30、34、40 d收集犬糞，樣品分別標(biāo)記為Eg0、Eg1、Eg2、Eg3、Eg4、Eg5、Eg6。參照Terry L A等[18]的方法，糞便解凍后加3×磷酸鹽緩沖液和2×蛋白酶抑制劑(不含EDTA)(Roche,Welwyn Garden City,UK)，每份犬糞上清渦旋振蕩5 min～10 min直至均勻，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白與肽段提取 每2 g犬糞上清中加入300 mL LB(裂解緩沖液lysis buffer)，冰浴充分研磨、超聲，直至充分溶解。4℃、13 500 r/min離心15 min，離心2次，吸取上清液，丙酮冰浴沉淀30 min，4℃、13 500 r/min離心15 min，離心2次，棄掉上清液，4℃干燥5 min，40 mmol/L NH4HCO3充分溶解沉淀后測定蛋白濃度。取蛋白做SDS-PAGE凝膠電泳，整個蛋白條帶用刀切成約1 mm3的小塊，放入EP管中，向管中加入500 μL純水，洗滌10 min，重復(fù)2次；向管中加入500 μL乙腈，脫水10 min；加入二硫蘇糖醇(DTT)終濃度為10 mmol/L的25 mmol/L NH4HCO3，56℃水浴1 h；加入碘代乙酰胺(IAM)終濃度為55 mmol/L的25 mmol/L NH4HCO3，暗室室溫放置45 min；向管中加入500 μL的25 mmol/L NH4HCO3，洗滌10 min，重復(fù)2次；向管中加入500 μL乙腈，脫水10 min；抽干乙腈，加入0.01 μg/μL的Trypsin 50 μL，37℃酶解過夜；加1 mL/L甲酸(FA)終止反應(yīng)。用200 μL含500 mL/L乙腈和 1 mL/L甲酸的混合物提取1次；用100%乙腈200 μL 1 mL/L甲酸提取2次；收集所有上清，并真空干燥。

1.2.3 基于QE(美國通用電氣公司，General Electric Company)的液質(zhì)聯(lián)用分析 參考Huo X等[19]的方法，除去蛋白中的不溶物質(zhì)后通過納升液相色譜儀進(jìn)行分離。設(shè)置分離程序后，依據(jù)參數(shù)在母離子中挑選電荷為2+～5+，峰強(qiáng)度超過20 000的15個母離子進(jìn)行二級分析，用碰撞能量為27的HCD模式對肽段進(jìn)行碎裂，碎片在Orbi中檢測。

1.2.4 蛋白的生物信息學(xué)分析 對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭測序(De novo)計算后，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)的檢索，利用Overlapping Peaks軟件對所得質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，然后選擇細(xì)粒棘球絳蟲蛋白數(shù)據(jù)庫和犬蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜庫,假陽性率(FPR, false positive rate)利用反庫(decoy)估算FDR 值(estimate FDR with decoy-fusion)，并控制在1%以下，被鑒定蛋白至少應(yīng)有2個以上的特有(unique)肽段，且驗(yàn)證正確的概率>95%。用kobas軟件在P<0.05的條件下，對感染犬不同時間犬糞中細(xì)粒棘球絳蟲蛋白進(jìn)行功能富集[20-21]。

2 結(jié)果

2.1 未感染細(xì)粒棘球蟲的犬糞樣品蛋白鑒定結(jié)果

搜索細(xì)粒棘球絳蟲和犬的混合蛋白數(shù)據(jù)庫，在FDR<1%、UNIQUEpeptide>2的搜索條件下搜索到的12個細(xì)粒棘球絳蟲蛋白，定義為細(xì)粒棘球絳蟲蛋白同源蛋白或相似物，即假陽性(表1)，在所有鑒定到的蛋白中排除這12個蛋白質(zhì)。

2.2 感染細(xì)粒棘球蟲不同時間點(diǎn)犬糞蛋白的鑒定

在Eg0～Eg6共6個時間點(diǎn)共鑒定到了78個蛋白。Eg1鑒定到了31個蛋白，其中21個蛋白為該時間特有；Eg2鑒定到了15個蛋白，其中有3個為該時間特有；Eg3中共鑒定到26個蛋白，其中11個為該時間特有；Eg4中鑒定到14個蛋白，其中3個蛋白為該時間特有；Eg5中共鑒定到24個蛋白，其中10個為該時間特有；Eg6中鑒定到10個蛋白，其中6個為該時間特有(表2)。

2.3 犬糞中細(xì)粒棘球蟲蛋白的功能富集

用Kobas軟件對感染細(xì)粒棘球絳蟲的犬不同時間的犬糞中細(xì)粒棘球絳蟲蛋白進(jìn)行功能富集，P<0.05的條件下，Eg1富集到嘌呤代謝(purine metabolism)、肌醇磷酸鹽代謝(inositol phosphate metabolism)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)；Eg2富集到RNA降解(RNA degradation)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)；Eg3和Eg4共同富集到富集到碳代謝(carbon metabolism)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)和糖酵解(glycolysis/gluconeogenesis)；Eg5富集到RNA降解(RNA degradation)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)；Eg6富集到氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、碳代謝(carbon metabolism)、RNA降解(RNA degradation)和糖酵解(gycolysis/gluconeogenesis)等代謝通路(圖1)。

表1 犬糞樣品中細(xì)粒棘球絳蟲蛋白同源蛋白或相似物的鑒定

注：蛋白登錄號是一種蛋白質(zhì)與Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫唯一對應(yīng)的編號。

Note:Protein accession number is the unique corresponding number of a protein in the Uniprot protein data bank.

表2 感染犬不同時間糞中細(xì)粒棘球絳蟲蛋白的鑒定

續(xù)表2

蛋白質(zhì)登錄號Proteinaccessionnumber類型描述Description時間TimeE1E2E3E4E5E6tr|A0A068WJX2|A0A068WJX2-ECHGR組蛋白H4HistoneH4√tr|A0A068WMG7|A0A068WMG7-ECHGR組蛋白H4HistoneH4√tr|A0A068WPV2|A0A068WPV2-ECHGR組蛋白H4HistoneH4√tr|A0A068X0X0|A0A068X0X0-ECHGR糖原磷酸化酶Glycogenphosphorylase√tr|W6U8C7|W6U8C7-ECHGR染色質(zhì)域-解旋酶-DNA-結(jié)合蛋白Chromodomain-helicase-DNA-bindingprotein√tr|W6UB03|W6UB03-ECHGR卡塞林素-1Calsyntenin-1√tr|W6UN17|W6UN17-ECHGR卡塞林素-1Calsyntenin-1√tr|W6UP55|W6UP55-ECHGR包含緩沖區(qū)域蛋白Cachedomaincontainingprotein√tr|W6V269|W6V269-ECHGR基底膜特異性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白Basementmembrane-specificheparansulfateproteoglycancoreprotein√tr|W6V2K4|W6V2K4-ECHGR基底膜特異性硫酸乙酰肝素Basementmembranespecificheparansulfate√tr|A0A068WDS5|A0A068WDS5-ECHGRATP依賴性RNA解旋酶DDX20ATPdependentRNAhelicaseDDX20√√√√tr|W6V0W8|W6V0W8-ECHGRATP依賴性DNA解旋酶2亞單位2ATPdependentDNAhelicase2subunit2√√√√tr|U6JN05|U6JN05-ECHGR*ATP結(jié)合盒亞家族BMDR:TAPATPbindingcassettesubfamilyBMDR:TAP√√√√√tr|W6TZP8|W6TZP8-ECHGR*膜聯(lián)蛋白Annexin√√√√√tr|W6ULY2|W6ULY2-ECHGR*α-14葡聚糖磷酸化酶Alpha-14glucanphosphorylase√√√√√tr|W6V4D7|W6V4D7-ECHGRα-11葡聚糖磷酸化酶Alpha-11glucanphosphorylase√√√tr|W6UKC4|W6UKC4-ECHGR腺苷酸激酶2Adenylatekinase2√√tr|A0A068WJD9|A0A068WJD9-ECHGR線粒體腺苷酸激酶2Adenylatekinase2mitochondrial√√tr|A0A068WP10|A0A068WP10-ECHGR腺苷酸環(huán)化酶9Adenylatecyclase9√√tr|U6JN02|U6JN02-ECHGR78ku糖相關(guān)蛋白78kuglucose-regulatedprotein√√tr|A0A068W8V8|A0A068W8V8-ECHGR核糖體蛋白L40RibosomalproteinL40√tr|A0A068WH84|A0A068WH84-ECHGR剪接因子3b亞基1Splicingfactor3bsubunit1√tr|W6UA56|W6UA56-ECHGR細(xì)胞質(zhì)氨基肽酶Cytosolaminopeptidase√tr|W6USS6|W6USS6-ECHGR泛素Ubiquitin√tr|A0A068WM60|A0A068WM60-ECHGR聚泛素Polyubiquitin√√tr|A0A068WQT5|A0A068WQT5-ECHGR泛素核糖體蛋白L40UbiquitinribosomalproteinL40√√

續(xù)表2

蛋白質(zhì)登錄號Proteinaccessionnumber類型描述Description時間TimeE1E2E3E4E5E6tr|A0A068WVL5|A0A068WVL5-ECHGR*泛素核糖體蛋白L40UbiquitinribosomalproteinL40√√tr|W6TYX3|W6TYX3-ECHGR*泛素Ubiquitin√√tr|W6UDU1|W6UDU1-ECHGR*泛素Ubiquitin√√tr|A0A068W862|A0A068W862-ECHGR血影蛋白β鏈Spectrinbetachain√tr|A0A068WMT0|A0A068WMT0-ECHGR微管連接蛋白4Sortingnexin4√tr|A0A068WNJ6|A0A068WNJ6-ECHGR磷酸簇分選蛋白Phosphofurinacidicclustersortingprotein√tr|A0A068WRJ7|A0A068WRJ7-ECHGR組蛋白賴氨酸N甲基轉(zhuǎn)移酶HistonelysineNmethyltransferase√tr|A0A068WVV7|A0A068WVV7-ECHGRRUN結(jié)構(gòu)域含有蛋白1RUNdomaincontainingprotein1√tr|A0A068WZ77|A0A068WZ77-ECHGR線粒體延長因子GElongationfactorGmitochondrial√tr|U6JHZ3|U6JHZ3-ECHGR116kuU5小核核糖核蛋白116kDaU5smallnuclearribonucleoprotein√tr|U6JKF3|U6JKF3-ECHGR*ATP合酶亞基OATPsynthasesubunitO√tr|W6U1F9|W6U1F9-ECHGR功能不明蛋白Uncharacterizedprotein√tr|W6UJ46|W6UJ46-ECHGR線粒體延長因子GElongationfactorGmitochondrial√tr|W6V4I2|W6V4I2-ECHGR磷酸簇分選蛋白Phosphofurinacidicclustersortingprotein√tr|U6JF50|U6JF50-ECHGRRas相關(guān)蛋白RABD2ARas-relatedproteinRABD2A√√tr|A0A068WC57|A0A068WC57-ECHGR*Ras蛋白rab8bRasproteinrab8b√√√tr|W6U129|W6U129-ECHGR*組蛋白HistoneH4√√√tr|W6USR3|W6USR3-ECHGR*Ras蛋白rab8bRas-relatedproteinRab-8B√√√tr|A0A068WXI3|A0A068WXI3-ECHGR紅細(xì)胞膜蛋白Erythrocytemembraneprotein√√tr|A0A068X0R4|A0A068X0R4-ECHGRATP合酶α亞基ATPsynthasesubunitalpha√√√tr|A0A068WKF3|A0A068WKF3-ECHGR鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶Calcium-transportingATPase√√tr|W6UDK0|W6UDK0-ECHGR鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶Calcium-transportingATPase√√tr|A0A068WRP1|A0A068WRP1-ECHGR糖蛋白N乙酰半乳糖胺GlycoproteinNacetylgalactosamine√tr|A0A068X2X2|A0A068X2X2-ECHGR熱激蛋白70Heatshockprotein70√tr|W6UN55|W6UN55-ECHGR天冬氨酰-tRNA合成酶Aspartyl-tRNAsynthetase√tr|A0A068WKN2|A0A068WKN2-ECHGR動力蛋白重鏈Dyneinheavychain√tr|A0A068WNX7|A0A068WNX7-ECHGR生長停滯特異性蛋白8Growtharrestspecificprotein8√

續(xù)表2

蛋白質(zhì)登錄號Proteinaccessionnumber類型描述Description時間TimeE1E2E3E4E5E6tr|A0A068WQE8|A0A068WQE8-ECHGR膠原蛋白α1V鏈Collagenalpha1Vchain√tr|A0A068WZV7|A0A068WZV7-ECHGR神經(jīng)母細(xì)胞瘤擴(kuò)增序列Neuroblastomaamplifiedsequence√tr|U6JEY5|U6JEY5-ECHGRADP核糖基化因子4ADPribosylationfactor4√tr|W6U4B3|W6U4B3-ECHGR動力蛋白重鏈5軸突Dyneinheavychain5axonemal√tr|W6U8Q5|W6U8Q5-ECHGR生長停滯特異性蛋白Growtharrest-specificprotein√tr|W6UFG1|W6UFG1-ECHGRADP核糖基化因子ADP-ribosylationfactor√tr|W6US03|W6US03-ECHGR膠原α-2I鏈核仁蛋白Collagenalpha-2(I)chain√tr|W6UVD7|W6UVD7-ECHGR核蛋白Nucleolarprotein√tr|W6URL4|W6URL4-ECHGR真核翻譯起始因子3亞基CEukaryotictranslationinitiationfactor3subunitC√tr|A0A068WB35|A0A068WB35-ECHGR染色體蛋白的結(jié)構(gòu)維持Structuralmaintenanceofchromosomesprotein√√tr|A0A068WTN7|A0A068WTN7-ECHGR磷脂酰肌醇4磷酸3激酶C2Phosphatidylinositol4phosphate3kinaseC2√tr|A0A068WW50|A0A068WW50-ECHGR甲狀腺激素α受體Thyroidhormonereceptoralpha√tr|W6U2Y8|W6U2Y8-ECHGR平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶Myosinlightchainkinasesmoothmuscle√tr|W6UT79|W6UT79-ECHGR染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白1AStructuralmaintenanceofchromosomesprotein1A√

注：E1、E2、E3、E4、E5、E6為感染細(xì)粒棘球絳蟲后不同時期的犬糞樣品。畫有“√”符號的為該時期具有的蛋白。畫有“*”符號的為該時間肽段覆蓋結(jié)合可信度較高蛋白。

Note: E1, E2, E3, E4, E5 and E6 represent dog feces at different time post-infection withEchinococcusgranulosus. "√" indicates the protein at the special time."*" means the high abundance proteins at the special time.

3 討論

目前，市場上還沒有出現(xiàn)具備檢測犬細(xì)粒棘球絳蟲感染21 d之前的糞抗原試劑盒。有研究表明，細(xì)粒棘球絳蟲感染犬25 d左右，蟲體已具備頭節(jié)、頸節(jié)、吸盤和吻突等結(jié)構(gòu)。感染35 d左右，蟲體節(jié)片數(shù)增多且生殖器官發(fā)育完全，但無蟲卵。細(xì)粒棘球絳蟲在犬體內(nèi)發(fā)育40 d左右進(jìn)入成熟階段開始排卵即具有感染性[22-23]。因此，選擇感染細(xì)粒棘球絳蟲0、16、21、25、30、34、40 d等不同時間對細(xì)粒棘球絳蟲蛋白進(jìn)行分析。感染16 d所富集到的蛋白功能主要是參與嘌呤代謝、氧化磷酸化、肌醇磷酸鹽代謝；感染21 d和34 d后所富集到的蛋白功能主要是參與氧化磷酸化和RNA降解；感染25 d和30 d后所富集到的蛋白功能主要是參與碳代謝、糖酵解、氧化磷酸化；感染40 d后所富集到的蛋白功能主要是參與碳代謝、糖酵解、氧化磷酸化和RNA降解。本研究結(jié)果顯示，細(xì)粒棘球絳蟲發(fā)育的各個時間均存在氧化磷酸化供能現(xiàn)象。E1～E5時期共有的蛋白是ATP binding cassette subfamily B MDR:TAP、Annexin和Alpha-1 4 glucan phosphorylase，這些蛋白均與氧化磷酸化過程直接相關(guān)。

在犬感染細(xì)粒棘球絳蟲16 d時所富集到的特有蛋白共21個，其功能主要是參與嘌呤代謝、氧化磷酸化、肌醇磷酸鹽代謝。嘌呤代謝是動物含氮廢物排出體外的重要途徑之一。肌醇是一類具有不同細(xì)胞功能的分子，最常見的是環(huán)己烷的異構(gòu)體，是所有真核生物體內(nèi)產(chǎn)生肌醇磷酸和肌醇磷脂的一種重要前體。寄生蟲的體表覆蓋大量的葡糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白[24-25]、脂磷酸聚糖及糖基肌醇磷脂(GIPLs)等多種成分[24，26-27]。這些分子都具有非常重要的功能，包括逃避宿主的免疫應(yīng)答[28]、激發(fā)炎癥反應(yīng)[29-30]、附著于宿主特定的組織[31-32]以及防止自身蛋白酶降解[33-34]等。另外，GPI錨定的脂質(zhì)部分對宿主的信號傳導(dǎo)通路起調(diào)節(jié)作用[33]。犬感染細(xì)粒棘球絳蟲16 d后，富集到這些與肌醇代謝相關(guān)的蛋白，該時間的特有蛋白可能提示細(xì)粒棘球絳蟲肌醇代謝非常活躍，然而目前在臨床檢測方面，該時間的感染尚不能被檢測到，這就提示我們研究該時間有關(guān)蛋白，可為建立早期檢測方法提供分子依據(jù)。寄生蟲可以通過周期性地改變由GPI錨定的變異表面糖蛋白(VSG)，逃避宿主的免疫應(yīng)答。因此，特異性地抑制細(xì)粒棘球絳蟲GPI生物合成可以成為治療該病或消除感染的有效途徑。

A～F分別為Eg1～Eg6樣品蛋白的功能富集結(jié)果。圖中黑色部分代表的是該代謝通路中所有的基因，陰影部分為細(xì)粒棘球絳蟲蛋白基因所占比例。X軸為代謝通路中基因的數(shù)量，Y軸為所富集到的功能目錄

A-F display the enrichment results of the functions of proteins respectively from Eg1-Eg6 samples.The black part of the figure represents all the genes involved in the metabolic pathways,and the shadow mapping part is the proportion ofEchinococcusprotein genes accounting for the genes.X axis denotes the number of genes in metabolic pathways,while Y axis does the directory of the functions which were enriched

圖1感染細(xì)粒棘球蟲不同時間犬糞蛋白功能的富集

Fig.1 Enrichment functions of proteins in dog feces at different time post-infection withEchinococcusgranulosus

犬感染細(xì)粒棘球絳蟲21、34、40 d后，均發(fā)現(xiàn)了與RNA降解相關(guān)功能的蛋白。結(jié)合細(xì)粒棘球絳蟲的生長規(guī)律，我們推測，犬感染細(xì)粒棘球絳蟲21 d后，宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抑制細(xì)粒棘球絳蟲的生長，宿主分泌的相關(guān)酶對寄生蟲RNA進(jìn)行降解；犬感染細(xì)粒棘球絳蟲34 d左右，細(xì)粒棘球絳蟲的生殖器官基本發(fā)育完好，蟲體發(fā)育已趨于成熟，但宿主機(jī)體免疫應(yīng)答仍存在，蟲體可能啟動免疫逃避機(jī)制，導(dǎo)致RNA降解的發(fā)生；在犬感染細(xì)粒棘球絳蟲40 d左右，成蟲已經(jīng)開始排出蟲卵，孕節(jié)脫落，功能衰退的蟲體可能會自行衰亡，由于對生存環(huán)境的適應(yīng)，自身分泌RNA降解酶導(dǎo)致RNA降解的發(fā)生。RNA 降解影響很多生命活動，是基因表達(dá)調(diào)節(jié)的重要途徑，有時mRNA對基因的調(diào)控可以占到基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用的50%，因此研究mRNA的穩(wěn)定性對基因表達(dá)調(diào)節(jié)具有十分重要意義[35]。在不同生物中，mRNA往往會由于甲基化的程度或位置不同而存在多種不同的帽子結(jié)構(gòu)，目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)和線蟲與哺乳動物的mRNA有著不同的帽子結(jié)構(gòu)，而且人類對這種帽子結(jié)構(gòu)的親和力比寄生蟲低數(shù)百倍，深入了解寄生蟲結(jié)合帽子的機(jī)制，將非常有利于研發(fā)新型且廣譜的抗寄生蟲藥物[36]。對犬感染細(xì)粒棘球絳蟲不同時期RNA降解機(jī)制進(jìn)行針對性的研究有助于闡明細(xì)粒棘球絳蟲在宿主體內(nèi)的生活機(jī)制，為該病的診斷與治療提供基礎(chǔ)。

犬感染細(xì)粒棘球絳蟲25、30、40 d后，與碳代謝和糖酵解過程有關(guān)酶的表達(dá)豐富，這些酶可能與生物合成和葡萄糖代謝有關(guān)。Gan W J等[37]通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球絳蟲中與碳代謝和糖酵解有關(guān)的酶是乳酸脫氫酶(LDH)，在生理?xiàng)l件下負(fù)責(zé)催化丙酮酸還原成乳酸。重組蛋白的酶活性被蛋白質(zhì)抗體或包含催化中心的關(guān)鍵殘基或底物結(jié)合位點(diǎn)的抗原表位所抑制，認(rèn)為LDH是抗細(xì)粒棘球絳蟲藥物和疫苗研究的一個潛在靶標(biāo)。這表明對生物代謝途徑的研究會給治療細(xì)粒棘球絳蟲感染的研究提供新思路。另外，在臨床檢測方面，犬細(xì)粒棘球絳蟲25 d～40 d時間段的感染已經(jīng)能被檢測出來，因此，本研究這個時間段有關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能會對細(xì)粒棘球絳蟲診斷抗原的篩選與研究奠定一定的基礎(chǔ)，并為疫苗的開發(fā)與研制提供新的方向。但值得注意的是，犬感染細(xì)粒棘球絳蟲34 d并未富集到與生物合成和葡萄糖代謝有關(guān)蛋白，這可能是由于該時期存在功能尚不明確的蛋白，也可能是此時不表達(dá)這些相關(guān)蛋白。這項(xiàng)研究提示，對于鑒定到的肽段覆蓋結(jié)合可信度較高的蛋白將作為后期重點(diǎn)研究對象進(jìn)行克隆表達(dá)與進(jìn)一步驗(yàn)證，通過動物試驗(yàn)獲得多克隆抗體，建立ELISA，并對收集的細(xì)粒棘球絳蟲犬糞陽性樣品進(jìn)行檢測，進(jìn)一步篩選得到特異性強(qiáng)、敏感度高的診斷抗原，并挑選幾種理想的抗原，有目的地制備相應(yīng)蛋白的單克隆抗體，從而為試劑盒的研發(fā)提供新的方法和途徑。

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