轉基因大豆MON89788雙重數(shù)字PCR通用定量檢測方法的建立

劉 津，李 婷，冼鈺茵，吳希陽，凌 莉，高東微,*

（1.廣東檢驗檢疫技術中心，廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623；2.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632）

全球轉基因作物種植已逾20 年，種植面積從1996年的170萬 hm2增加了100 倍，達到了2015年的1.797億 hm2，20 年來累計種植面積達到空前的20億 hm2，相當于中國大陸總面積的2 倍[1]。隨著轉基因作物在全球范圍內(nèi)的大規(guī)模種植和消費，越來越多的國家和地區(qū)開始實施轉基因產(chǎn)品標識管理制度。鑒于轉基因作物在種植收割、生產(chǎn)加工和運輸消費等過程中會出現(xiàn)不可避免的混雜，目前有60多個國家和地區(qū)對轉基因產(chǎn)品標識設置了閾值，如歐盟規(guī)定合法轉基因成分標識閾值為0.9%、非法轉基因成分標識閾值為0.5%，巴西、澳大利亞、新西蘭、沙特阿拉伯、以色列設定的標識閾值為1%，韓國設定的標識閾值為3%，日本和俄羅斯設定的標識閾值為5%[2]。這些國家和地區(qū)規(guī)定，產(chǎn)品中轉基因成分含量低于閾值可以免于標識。轉基因標識閾值逐漸成為大勢所趨，我國相關部門也正在研究將其引入轉基因安全管理體系當中。標識閾值的采用，為轉基因安全管理帶來更加科學合理的技術措施，同時也對轉基因成分的精準定量提出了迫切而具體的需求。

在數(shù)字聚合酶鏈式反應（digital polymerase chain reaction，dPCR）技術出現(xiàn)以前，轉基因成分的定量檢測基本采用實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）技術[3-5]，通過繪制不同濃度梯度標準物質與循環(huán)閾值之間的線性標準曲線，基于標準物質和待測樣品的DNA提取與PCR擴增效率一致的假設，用待測樣品qPCR的循環(huán)閾值對照標準曲線計算得到其中轉基因成分的含量。這種定量檢測技術在實際應用中局限性極大：梯度標準物質不易獲得，標準物質與待測樣品存在天然的本質差異，實驗步驟和計算過程繁瑣導致測量誤差在多個環(huán)節(jié)累積放大，加之痕量轉基因成分的測定結果重復性差等，因此定量結果相對粗略，不能達到閾值管理所需要的痕量、精準的定量技術水平。

dPCR基于單分子目標基因PCR擴增，PCR反應液被分配到大量獨立的反應室中進行單拷貝核酸獨立熒光PCR擴增，根據(jù)泊松分布原理進行矯正并計算出初始樣品中目標核酸的精確拷貝數(shù)濃度[6-8]。dPCR主要有微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和芯片式數(shù)字PCR（chip digital PCR，cdPCR）[9]，目前這兩種dPCR在研究和應用領域可謂平分秋色。由于無需依賴梯度濃度標準物質繪制標準曲線即可對目標核酸進行準確的拷貝數(shù)定量，利用外源基因與內(nèi)源基因拷貝數(shù)比例即可計算出轉基因成分相對含量，避免了qPCR技術在實際應用中的各種局限，因此dPCR技術已被數(shù)次報道用于轉基因成分定量檢測的研究中[10-16]。

MON89788品系是美國孟山都公司研發(fā)的抗草甘膦除草劑轉基因大豆，最早于2007年被美國、菲律賓和加拿大批準種植，允許作為食品或飼料直接食用或加工。2008年8月28日MON89788品系首次獲得我國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的進口安全證書，僅可用于原料加工[17]。目前，除我國以外，澳大利亞、哥倫比亞、歐盟、新西蘭等22 個國家或地區(qū)批準該轉基因大豆品系用于食品和飼料中。目前轉基因大豆MON89788品系的官方檢測方法包括農(nóng)業(yè)部1485號公告—6—2010《轉基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 耐除草劑大豆MON89788及其衍生品種定性PCR方法》[18]和歐盟官方方法CRLVL05/06VR《大豆MON89788品系特異性定量實時PCR檢測方法》[3]，農(nóng)業(yè)部標準方法采用普通PCR進行定性檢測，歐盟官方方法采用實時熒光PCR進行相對定量檢測。國內(nèi)外鮮有采用dPCR進行精準定量檢測的報道。盡快建立轉基因大豆MON89788品系的dPCR定量檢測方法，使之通用于主流的ddPCR和cdPCR平臺，對構建我國轉基因定量檢測技術體系，為日后閾值管理做好技術儲備，具有重要的實用價值和示范作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗以轉基因大豆MON89788品系為研究對象，25 份其他種類轉基因標準物質和4 份本實驗室留存的非轉基因植物材料為特異性實驗材料，1 份來自食品分析能力評價體系（food analysis performance assessment scheme，F(xiàn)APAS）國際能力驗證項目的動物飼料樣品為盲樣檢測實驗材料，具體情況見表1。

ddPCR：ddPCRTM預混液、微滴生成油、微滴分析油、微滴生成卡槽、微滴生成卡槽膠墊和96 孔板，購自美國Bio-Rad公司；cdPCR：QuantStudio?預混液（3D Digital PCR Master Mix v2）、芯片試劑盒（3D Digital PCR 20K Chip Kit v2，包含芯片、芯片蓋、刷頭、封油注射器），購自美國Applied Biosystems by Life Technologies公司；TIANGEN?植物基因組DNA提取試劑盒（CAT：#DP30502）購自天根生化科技（北京）有限公司；引物和探針均由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

QX200TMDroplet Digital PCR系統(tǒng)（包括C1000 TouchTM熱循環(huán)儀、微滴生成儀、微滴分析儀和封膜儀4 個部分） 美國Bio-Rad公司；QuantStudioTM3D Digital PCR系統(tǒng)（包括Dual Flat Block GeneAmp? PCR System 9700、芯片裝載儀和芯片分析儀3 個部分）美國Applied Biosystems by Life Technologies公司；Nanodrop 1000核酸蛋白分析儀 美國Thermo Scientific公司；Rainin?E4-200XLS＋單通道電動移液槍 美國瑞寧公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

實驗材料基因組DNA的提取參照TIANGEN?植物基因組DNA提取試劑盒說明書。

1.3.2 引物和探針及特異性實驗

建立MON89788品系雙重dPCR定量檢測方法，一個反應體系中同時進行品系特異性外源基因和內(nèi)源基因擴增，對拷貝數(shù)定量檢測。品系特異性序列MON89788為外源基因插入序列與大豆基因組序列之間5′邊界的跨界序列，參考歐盟方法CRLVL05/06VR《大豆MON89788品系特異性定量實時PCR檢測方法》[3]的序列信息。大豆內(nèi)源基因序列Lectin為植物凝集素基因lectin，參考歐盟方法CRLVL01/08VP《大豆A5547-127品系特異性定量實時PCR檢測方法》[19]的序列信息。MON89788探針采用5′-FAM—3′-BHQ1熒光標記，Lectin探針在歐盟方法的序列5′端增加A、G兩個堿基，并采用5′-VIC—3′-BHQ1熒光標記。兩個目標序列在大豆基因組中均為單拷貝，具體見表2。

表2 引物和探針序列Table2 Sequences of primers and probes used in this study

采用表1中序號1～30的實驗材料，對植物組織類型的實驗材料按照1.3.1節(jié)進行DNA提取，對30 個實驗材料的基因組DNA按照歐盟方法CRLVL01/08VP的反應體系和反應條件進行實時熒光PCR擴增，每個樣品設置2 個PCR平行，考察引物探針的特異性。

1.3.3 ddPCR體系和反應條件

ddPCR體系為20μL：ddPCRTM預混液 10 μL；MON89788和Lectin正反向引物各0.8 μL（10 pmol/μL）、MON89788和Lectin探針各0.4 μL（10 pmol/μL），DNA模板2 μL，補水至20 μL。分別將20 μL的反應體系和70 μL微滴生成油加入微滴生成卡槽中，蓋上膠墊后放入微滴生成儀中進行微滴生成，待微滴生成結束后用單通道電動移液槍將生成的微滴（大約40 μL）全部轉移至96 孔板中，用封膜儀進行封膜后置于熱循環(huán)儀中進行PCR。

反應條件：95 ℃ 5min（1 ℃/s）；94 ℃ 15 s（1 ℃/s）；60 ℃ 1 min（1 ℃/s），共49 個循環(huán)；98 ℃ 10 min（1 ℃/s），12 ℃保存反應產(chǎn)物。

擴增結束后將96 孔板置于微滴分析儀中讀取熒光信號，并用QuantaSoft V1.3.2軟件分析實驗數(shù)據(jù)。

1.3.4 cdPCR體系和反應條件

cdPCR體系為15 μL：QuantStudio?預混液7.5 μL；MON89788和Lectin正反向引物各0.6 μL（10 pmol/μL）、MON89788和Lectin探針各0.3 μL（10 pmol/μL），DNA模板1.5 μL，補水至15 μL。將配制好的15 μL反應體系通過芯片裝載儀自動加載到芯片上的微孔中，體系加載完成后立即使用封油注射器將封油覆蓋于芯片表面并將芯片密封。密封后的芯片放置于PCR系統(tǒng)上進行擴增。

反應條件：96 ℃ 10 min；60 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，49 個循環(huán)；60 ℃ 2 min；10 ℃保存反應產(chǎn)物。

擴增結束后，待芯片恢復至室溫，將芯片置于芯片分析儀中讀取并初步分析芯片結果，再經(jīng)由QuantStudioTM3D AnalysisSuiteTM Cloud Software二次分析實驗數(shù)據(jù)。

1.3.5 重復性實驗

以50 ng/μL的轉基因大豆MON89788標準物質基因組DNA為模板，分別按照ddPCR和cdPCR的反應體系和反應條件進行PCR擴增。每種dPCR設置3 個平行，軟件分析后記錄有效反應數(shù)和拷貝數(shù)濃度，分別計算平均值和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），以RSD不大于25%作為有效定量數(shù)據(jù)的判斷依據(jù)，評價方法的可重復性。

1.3.6 定量線性范圍的測定

將150 ng/μL的轉基因大豆MON89788標準物質基因組DNA用Tris-EDTA緩沖液稀釋，得到150、50、10、2、0.4、0.08、0.04 ng/μL共7 個工作質量濃度的DNA溶液。分別取7 個工作質量濃度的DNA溶液為模板，按照ddPCR和cdPCR的反應體系和反應條件進行PCR擴增，每個質量濃度設置3 個平行。計算各質量濃度DNA檢測結果的平均值和RSD值。以RSD不大于25%作為有效定量數(shù)據(jù)的判斷依據(jù)，并定義絕對定量限為檢測結果RSD不大于25%時最低拷貝數(shù)濃度。以DNA工作質量濃度為橫坐標，以拷貝數(shù)濃度的有效定量數(shù)據(jù)為縱坐標，分別繪制MON89788和Lectin檢測的ddPCR和cdPCR線性相關性曲線。

1.3.7 相對定量檢測低限的測定

將150 ng/μL的轉基因大豆MON89788標準物質基因組DNA用含150 ng/μL的非轉基因大豆基因組DNA的Tris-EDTA緩沖液進行10 倍梯度稀釋，得到100%、10%、1%、0.1%和0.01%共5 個梯度相對含量的轉基因大豆MON89788 DNA溶液。分別取5 個梯度相對含量的DNA溶液為模板，按照ddPCR和cdPCR的反應體系和反應條件進行PCR擴增，每個梯度設置3 個平行。根據(jù)測得的MON89788和Lectin基因拷貝數(shù)濃度，按照下式求得轉基因大豆MON89788品系的相對含量，并計算測得的相對含量與理論相對含量的偏差、3 個平行相對含量的RSD。以RSD不大于25%作為有效定量數(shù)據(jù)的判斷依據(jù)，并定義相對定量限為檢測結果RSD不大于25%時最低相對含量。同時，利用上述偏差評價定量檢測方法的準確度和精密度。

轉基因品系MON89788的相對含量/%=100×MON89788拷貝數(shù)濃度/Lectin拷貝數(shù)濃度

1.3.8 盲樣檢測

為了評估本方法的適用性，應用建立的轉基因大豆MON89788雙重dPCR檢測方法完成FAPAS國際能力驗證項目“GeMMP26動物飼料中轉基因品系檢測”中的MON89788含量測定，按照1.3.1節(jié)進行基因組DNA提取和適當稀釋，按照ddPCR和cdPCR的反應體系和反應條件進行PCR擴增，每個濃度設置3 個平行。以FAPAS能力驗證評價結果作為本方法適用性的評判依據(jù)，并比較ddPCR和cdPCR的實際檢測效果。

2 結果與分析

2.1 引物探針特異性實驗結果

由表3可知，進行Lectin檢測時，序號1～13和序號27的實驗材料基因組DNA均夠檢出陽性信號，其他序號檢測結果陰性，說明Lectin引物探針在大豆檢測中具有良好的特異性。進行MON89788檢測時，只有序號1的實驗材料基因組DNA能夠檢出陽性信號，其他序號檢測結果陰性，說明MON89788引物探針對轉基因大豆MON89788品系檢測特異性好，不會對轉基因玉米、轉基因馬鈴薯、轉基因苜蓿、轉基因油菜、轉基因水稻和各種非轉基因植物發(fā)生交叉反應。特異性實驗結果表明，Lectin和MON89788引物探針適于進行后續(xù)dPCR定量檢測技術研究。

表3 引物和探針特異性實驗結果Table3 Specificity evaluation of primers and probes

2.2 dPCR定量檢測結果

對序號1的轉基因大豆MON89788基因組DNA進行雙重dPCR定量檢測，在ddPCR與cdPCR平臺的二維實驗結果圖分別見圖1和圖2。由圖1可知，ddPCR中，MON89788的本底熒光強度介于0～350之間，陽性擴增熒光強度介于4 500～7 800之間；Lectin的本底熒光強度介于1 500～1 900之間，陽性擴增熒光強度介于3 000～4 200之間，2 個基因的陽性微滴與陰性微滴之間界限分明。由圖2可知，cdPCR中，MON89788本底熒光強度介于0～3 200之間，陽性擴增熒光強度介于5 500～15 000之間；Lectin的本底熒光強度介于0～2 300之間，陽性擴增熒光強度介于3 200～7 000之間，2 個基因陽性微孔與陰性微孔之間界限分明。根據(jù)dPCR技術要求，上述結果表明本方法在ddPCR與cdPCR平臺都表現(xiàn)良好。相比較而言，ddPCR平臺的陽性擴增熱點比cdPCR平臺分布更為集中，拖尾情況更弱，陰陽性熱點之間的間隔更為分明，說明ddPCR的各個反應室間擴增效率更為均一，室間差異更小。

圖1 轉基因大豆MON89788雙重ddPCR 2D圖Fig. 1 2D amplitude map of duplex ddPCR for GM soybean event MON89788

圖2 轉基因大豆MON89788雙重cdPCR 2D圖Fig. 2 2D amplitude map of duplex cdPCR for GM soybean event MON89788

2.3 重復性實驗結果

由表4可知，2 個平臺產(chǎn)生的有效反應數(shù)平均值均在16 000以上，滿足泊松分布統(tǒng)計學原理對有效反應數(shù)大于10 000的要求。ddPCR和cdPCR平臺有效反應數(shù)的RSD值分別為5.49%和1.46%，均遠小于25%的評價標準。cdPCR有效反應數(shù)RSD值比ddPCR的小，考慮到cdPCR采用芯片裝載儀而ddPCR采用微滴生成儀進行反應體系的分散，相較之下ddPCR存在更多的人工操作步驟所致。2 個平臺對MON89788和Lectin的拷貝數(shù)濃度檢測，3 個平行結果RSD值在0.84%～1.99%之間，遠小于25%的評價標準。以上數(shù)據(jù)說明，2 個平臺均能得到重復性良好的檢測結果。

表4 轉基因大豆MON89788雙重dPCR重復性實驗結果Table4 Repeatability of duplex dPCR for detection of GM soybean event MON89788

2.4 定量線性范圍實驗結果

由表5可知，根據(jù)1.3.6節(jié)的判斷依據(jù)，ddPCR檢測MON89788的絕對定量限為8.0 copies/μL，RSD為15.66%；檢測Lectin的絕對定量限為8.2 copies/μL，RSD為19.22%。cdPCR檢測MON89788的絕對定量限為7.443 copies/μL，RSD為7.79%；檢測Lectin的絕對定量限為7.646 copies/μL，RSD為7.24%。

以反應體系中DNA模板添加質量濃度0.4～150 ng/μL為橫坐標，分別以ddPCR和cdPCR平臺的3 個平行檢測結果為縱坐標繪制線性范圍擬合曲線，由圖3和圖4可知，所得的4 條曲線中MON89788和Lectin的拷貝數(shù)濃度均與DNA模板添加濃度呈現(xiàn)高度的線性相關，相關系數(shù)達到0.99以上。說明建立的dPCR方法在2 個平臺均具有良好的定量線性相關性，適用于MON89788和Lectin的拷貝數(shù)濃度定量檢測。

表5 轉基因大豆MON89788雙重dPCR定量線性范圍實驗結果Table5 Quantitative linear range of duplex dPCR for GM soybean event MON89788

圖3 轉基因大豆MON89788雙重ddPCR定量線性范圍擬合曲線Fig. 3 Quantitative linear range fitting curves of duplex ddPCR for GM soybean event MON89788

圖4 轉基因大豆MON89788雙重cdPCR定量線性范圍擬合曲線Fig. 4 Quantitative linear range fitting curves of duplex cdPCR for GM soybean event MON89788

2.5 相對定量限結果

由表6可知，對于100%、10%、1%、0.1%和0.01%共5 個梯度相對含量的轉基因大豆MON89788 DNA溶液，ddPCR測得值分別為98.1%、10.2%、1.05%、0.17%和0.03%，偏差分別為-1.91%、0.20%、0.05%、0.07%和0.02%，RSD分別為3.24%、4.20%、5.99%、16.67%和48.49%；cdPCR測得值分別為99.4%、9.66%、1.2%、0.17%和0.03%，偏差分別為-3.63%、-0.34%、1.12%、0.07%和0.02%，RSD分別為2.71%、2.83%、6.97%、19.88%和40.05%。根據(jù)1.3.7節(jié)的判斷依據(jù)，ddPCR和cdPCR的相對定量限均為0.1%，且當轉基因大豆MON89788相對含量低至0.01%時2 個平臺仍能夠穩(wěn)定的檢出陽性結果。

表6 轉基因大豆MON89788雙重dPCR相對定量限實驗結果Table6 Relative LOQs of duplex dPCR for GM soybean event MON89788

2.6 盲樣檢測結果

表7 盲樣檢測實驗結果Table7 Results of detection of blind samples

盲樣提取基因組DNA并適當稀釋，得到質量濃度為1 235、400、100 ng/μL的DNA溶液，分別進行MON89788定量檢測。由表7可知，當DNA模板質量濃度為1 235 ng/μL時，cdPCR檢測MON89788的RSD值最小為3.21%，相對含量平均值為0.887%。因此，本實驗室以MON89788相對含量為0.887%報告檢測結果。FAPAS對全部18 家參試實驗室的定量結果進行統(tǒng)計，盲樣中MON89788含量中位值為1%，Z值±2以內(nèi)評價為“滿意”。實驗建立的檢測方法對盲樣的檢測結果獲得了Z值-0.3的結果，表現(xiàn)優(yōu)異。根據(jù)FAPAS評價標準，在DNA模板質量濃度為1 235 ng/μL和400 ng/μL時，所建立的檢測方法在ddPCR和cdPCR 2 個平臺均能獲得“滿意”的檢測結果。

3 討 論

國內(nèi)外開展dPCR轉基因成分定量檢測技術研究雖然剛剛起步，但是發(fā)展極快。Corbisier[10]、潘廣[20-21]、Demeke[22]、于曉帆[23]和任怡菲[24]等應用ddPCR分別建立了轉基因玉米MON810、玉米T25、玉米GA21、油菜OXY235、大豆DP305423、大豆DAS-44406-6和水稻LL62的品系特異性定量檢測方法；胡佳瑩等[25]應用cdPCR建立了轉基因玉米MON863的品系特異性定量檢測方法；Fu Wei等[26]應用ddPCR和cdPCR建立了CaMV35s啟動子和NOS終止子篩選基因定量檢測方法；Dobnik等[27]應用ddPCR技術建立了歐盟批準的12 種玉米品系的多重定量檢測方法。目前國內(nèi)ddPCR和cdPCR兩種平臺幾乎各占一半，顯然絕大多數(shù)研究僅僅基于一種dPCR平臺，不能滿足現(xiàn)實需要，導致很多研究成果在很多實驗室無法應用。雖然Fu Wei等[26]的研究同時在兩種平臺上開展，但是局限于兩種篩選基因的定量檢測，對于轉基因檢測中最大量、最迫切的品系檢測尚缺乏通用dPCR定量檢測技術開發(fā)和比較研究的報道。

ddPCR與cdPCR雖然均基于泊松分布原理進行目標核酸的拷貝數(shù)定量，但是由于反應體系分散系統(tǒng)和熒光信號檢測系統(tǒng)的差異，實驗設計、實驗操作和技術性能等方面存在明顯區(qū)別。總體上，ddPCR的技術要求更高，主要表現(xiàn)在：ddPCR推薦采用本底信號值更低的BHQ1或MGB作為淬滅基團，以便于熒光信號檢測系統(tǒng)更加有效的區(qū)分陰陽性信號；ddPCR體系分散為油包水的微滴，移液操作不慎易造成微滴破裂并導致有效反應數(shù)下降，移液設備優(yōu)先選擇電動移液槍和細長槍頭。與此同時，cdPCR采用芯片裝載儀進行反應體系的分散，實驗數(shù)據(jù)平行間的重復性較好。不過，由于cdPCR一次最多只能進行24 個反應且芯片裝載儀每次僅制作1 張芯片，而ddPCR最多能容納96 個反應并一次可制備8 個反應的微滴，所以一般情況下超過24 個樣品時采用ddPCR在操作上的耗時更短。但是，在進行少量樣品的檢測實驗時，ddPCR要求微滴生成操作數(shù)量必須是8的倍數(shù)，顯然在試劑損耗和時間消耗上cdPCR更為經(jīng)濟和便利。

在檢測靈敏度方面，由于無需梯度濃度標準物質制作標準曲線，有效避免了標準物質與待測樣品因狀態(tài)差異導致的DNA提取效率和PCR擴增效率不一致，從而極大降低了因此引起的測量誤差，dPCR與qPCR相比對目標核酸的檢測更加靈敏準確。根據(jù)我國已經(jīng)頒布的各種標準檢測方法[28]，轉基因成分qPCR的定性限為0.1%。本實驗相對定量限實驗結果表明，采用dPCR可穩(wěn)定檢出相對含量0.01%的轉基因大豆MON89788，與qPCR檢測技術相比定性檢測限降低10 倍。

目前全球轉基因標識管理最為謹慎的歐盟地區(qū)規(guī)定，轉基因成分標識閾值為0.9%[29]，轉基因成分定量檢測平行數(shù)據(jù)RSD可接受閾值為25%[30]，本實驗建立的轉基因大豆MON89788雙重dPCR通用定量檢測方法各項技術指標均可滿足最為嚴苛的管理規(guī)定，為我國相關標識閾值管理的技術儲備提供一種可靠的檢測手段。

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