嗜酸乳桿菌ATCC4356分選酶A基因克隆、表達(dá)及功能分析

吳 京，王文文，熊蓉露，吳 振,*，潘道東,,*，曾小群，郭宇星

（1.寧波大學(xué) 浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211；2.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的表面蛋白可以使細(xì)菌黏附于一些細(xì)胞和組織表面，這種機(jī)制可以促使細(xì)菌成功定殖于機(jī)體內(nèi)并逃避宿主的免疫監(jiān)視[1]。部分表面蛋白發(fā)揮作用之前需要分選酶A（sortase A，SrtA）的參與，它可以識(shí)別表面蛋白特定的LPXTG序列（X表示任意一種氨基酸），并將表面蛋白在蘇氨酸（T）和甘氨酸（G）之間切開(kāi)，使表面蛋白錨定在細(xì)胞壁上[2-3]。

分選酶是一種膜結(jié)合類(lèi)的轉(zhuǎn)肽酶，很多表面蛋白發(fā)揮功能之前都需要分選酶的參與。目前為止發(fā)現(xiàn)的6 種分選酶中，SrtA可以識(shí)別LPXTG等序列，使表面蛋白正常發(fā)揮功能[4]；可催化細(xì)菌的多種黏附素或毒力因子錨定在細(xì)胞壁表面，在致病菌入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。在對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的SrtA基因進(jìn)行敲除后發(fā)現(xiàn)，SrtA缺陷菌株生理狀況沒(méi)有明顯變化，但對(duì)宿主細(xì)胞的黏附作用大幅下降，從而很大程度上降低了病原菌的致病性[7-8]。

相較于其他革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，乳酸菌的分選酶及表面蛋白沒(méi)有毒性，因此其分選酶錨定機(jī)制被認(rèn)為是比較安全的。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌SrtA在細(xì)菌黏附過(guò)程中同樣扮演著重要角色。Malik等[9]研究了植物乳桿菌CMPG5300對(duì)陰道上皮細(xì)胞的黏附，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CMPG5300 SrtA基因被敲除后，自身的聚集效應(yīng)明顯降低，同時(shí)對(duì)陰道上皮細(xì)胞的黏附作用也會(huì)減弱，而對(duì)SrtA缺陷菌株進(jìn)行基因回補(bǔ)后，CMPG5300對(duì)細(xì)胞的黏附能力又有所回升，表明乳酸菌SrtA同樣會(huì)影響它對(duì)宿主細(xì)胞的黏附；SrtA基因的缺失也會(huì)影響其他基因的表達(dá)，并影響乳酸菌細(xì)胞膜的形成。

乳酸菌SrtA可以識(shí)別多種表面蛋白，并介導(dǎo)乳酸菌對(duì)腸道細(xì)胞的黏附，抑制病原菌的入侵[10-11]。雖然這些表面蛋白與腸道細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)尚不明確，但可以肯定的是，乳酸菌的表面蛋白可以抑制病原菌對(duì)腸道細(xì)胞的黏附，并提高乳酸菌在腸胃中的存活率；表面蛋白與腸道細(xì)胞受體結(jié)合還可以刺激免疫細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)人體免疫力[12-13]；乳酸菌SrtA也有望被開(kāi)發(fā)為一種蛋白質(zhì)連接工具[14]。因此，對(duì)乳酸菌SrtA的研究有助于進(jìn)一步探究表面蛋白的具體功能，揭示乳酸菌的益生機(jī)理。

目前為止，對(duì)SrtA的研究主要集中在致病菌及其抑制物的開(kāi)發(fā)上[15-17]，雖然獲得了諸多成果，但它們對(duì)分選酶家族的廣譜抑制效應(yīng)尚少見(jiàn)研究。乳酸菌作為人體腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道這些抑制劑對(duì)乳酸菌SrtA的影響。本研究擬利用pET28a（＋）載體對(duì)Lactobacillus acidophilus ATCC4356的SrtA進(jìn)行異源表達(dá)，并分析其酶學(xué)特性，期望獲得具有活性的SrtA，驗(yàn)證分選酶抑制劑對(duì)乳酸菌SrtA的抑制作用，為提高乳酸菌分選酶的催化效率以及為后續(xù)分選酶抑制劑的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

L. acidophilus ATCC4356、pET28a（＋）為本實(shí)驗(yàn)室保存；熒光多肽Dabcyl-QALPTTGEE（Edans）由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1、Transetta（DE3）、克隆載體pEASY-Blunt Zero、親和層析柱Ni-NTA Resin 北京全式金生物技術(shù)有限公司；高保真DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶 日本TaKaRa公司；查爾酮 天津一方科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

INFINITE M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；H2500R-2、H-2050R低溫離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Labnet公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Universal HoodⅡ凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；Mini Drop超微量分光光度計(jì) 依科賽生物科技有限公司；MC99-3自動(dòng)液相分離層析儀 上海滬西分析儀器廠(chǎng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 嗜酸乳桿菌SrtA基因的克隆及鑒定

表1 PCR引物序列Table1 Sequences of primers used for PCR

使用信號(hào)肽分析軟件SignaIP分析SrtA的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)L. acidophilus ATCC4356 SrtA（Lap-SrtA）存在一個(gè)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，位于第48個(gè)氨基酸處。根據(jù)分析結(jié)果，如表1所示，設(shè)計(jì)引物SrtAΔN48-F、SrtAΔN48-R去除Lap-SrtA N端48 個(gè)氨基酸，以XhoⅠ和BamHⅠ作為酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR克隆得到目的基因SrtAΔN48，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。PCR程序：98 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物割膠回收后與Blunt Zero克隆載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，卡納霉素篩選轉(zhuǎn)化子，雙酶切驗(yàn)證，并送至上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3.2 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用BamH I和Xho I分別雙酶切Blunt Zero-SrtAΔN48和完整質(zhì)粒pET28a（＋），瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，然后割膠回收目的基因SrtAΔN48和被切開(kāi)的載體pET28a（＋）。用T4 DNA連接酶連接pET28a（＋）與SrtAΔN48，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta（DE3），卡那霉素篩選轉(zhuǎn)化子。并通過(guò)雙酶切、測(cè)序等獲取重組表達(dá)載體pET28a-SrtAΔN48。

1.3.3 重組載體在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將含有重組表達(dá)載體pET28a-SrtAΔN48的大腸桿菌接種于卡那霉素質(zhì)量濃度為100 mg/mL的LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min 搖床培養(yǎng)至600 nm波長(zhǎng)吸光度約為0.6，加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）至終濃度為0.4 mmol/L，25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)16 h，同時(shí)以未加IPTG的培養(yǎng)物作為對(duì)照。誘導(dǎo)結(jié)束后，5 000 r/min離心收集菌體，用0.01 mol/L PBS緩沖液重懸，超聲波破碎細(xì)菌，10 000 r/min離心30 min，收集上清液，利用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳分析，確定蛋白表達(dá)情況。

1.3.4 重組蛋白的活性測(cè)定

分選酶活性測(cè)定選用Dabcyl-QALPTTGEE（Edans）熒光多肽，分選酶可以識(shí)別LPTTG序列，并在T與G之間切割肽鍵，使熒光基團(tuán)Edans脫落并發(fā)出熒光，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定分選酶的活性。熒光多肽Dabcyl-QALPTTGEE（Edans）用pH 7.5的Tris-HCl緩沖液稀釋至5 mmol/L作為儲(chǔ)備液。

純化的蛋白用蛋白活性緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，150 mmol/L NaCl溶液，pH 8.0）稀釋至0.5 mg/mL，加入96 孔板黑板中，并加入分選酶底物肽至終濃度為10 μmol/L（終反應(yīng)體系為200 μL），在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀記錄孵育前后體系中的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm），以蛋白活性緩沖液作為陰性對(duì)照。

為研究金屬離子對(duì)Lap-SrtA酶活性的影響，反應(yīng)體系中分別加入5 mmol/L的CaCl2、MgCl2、ZnCl2及MnCl2溶液（終反應(yīng)體系為200 μL），以不加任何金屬離子的反應(yīng)體系作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，測(cè)定反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.5 分選酶抑制劑查爾酮對(duì)重組蛋白活性的影響

查爾酮用二甲基亞砜溶解，加入反應(yīng)體系中，使其終濃度分別為20、40、80、120、160、200 μmol/L，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min后，加入熒光肽底物至終濃度為10 μmol/L（終反應(yīng)體系為200 μL），繼續(xù)孵育2 h，按之前的方法讀取熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.6 嗜酸乳桿菌SrtA生物信息學(xué)分析

分別用ExPASY、TMHMM、PSIPRED、SWISS MODEL[18-19]等蛋白質(zhì)在線(xiàn)分析軟件分析分選酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并與其他分選酶進(jìn)行比對(duì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用Origin 8.5軟件繪制趨勢(shì)曲線(xiàn)圖，采用一維方差分析比較數(shù)據(jù)平均值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SrtA基因的PCR擴(kuò)增和重組表達(dá)載體的構(gòu)建

圖1 SrtAΔN48基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of SrtAΔN48 gene

由圖1可知，以L(fǎng). acidophilus ATCC4356基因組DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為546 bp，符合預(yù)計(jì)長(zhǎng)度。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)NCBI對(duì)比，與L. acidophilus NCFM序列相似性為99%，氨基酸序列完全相同。將克隆載體Blunt Zero-SrtAΔN48雙酶切后得到的SrtAΔN48與pET28a（＋）連接，卡那霉素篩選陽(yáng)性菌，并送至上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示整個(gè)克隆過(guò)程中沒(méi)有引入突變堿基。

2.2 SrtA基因在大腸桿菌中的表達(dá)與純化

圖2 Transetta（DE3）/pET28a-SrtAΔN48的表達(dá)產(chǎn)物十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of expression product from Transetta (ED3)/pET28a-SrtAΔN48

將重組載體pET28a-SrtAΔN48轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Transetta（DE3），在25 ℃、0.4 mmol/L IPTG條件下表達(dá)及純化結(jié)果如圖2所示。SrtA作為一種膜蛋白，其氨基酸序列的N端含有一段強(qiáng)疏水性序列，包括跨膜區(qū)域和信號(hào)肽，這段序列可以使膜蛋白成功錨定在細(xì)胞壁上；但在基因異源表達(dá)過(guò)程中，疏水性序列會(huì)嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的正確折疊以及可溶性表達(dá)[7,20]。為獲得具有活性的SrtA蛋白，本研究設(shè)計(jì)引物去除了SrtA酶N端的48 個(gè)氨基酸，然后使用pET系列載體在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)目的基因Lap-SrtAΔN48。L. acidophilus ATCC4356 SrtA基因原本編碼229 個(gè)氨基酸，切除N端48 個(gè)氨基酸后，相對(duì)分子質(zhì)量會(huì)有所減小。由圖2可知，SrtAΔN48在約20 kDa的位置出現(xiàn)了明顯的條帶，同時(shí)，利用Ni-NTA親和層析柱，獲得了高純度的SrtAΔN48蛋白。

2.3 金屬離子及查爾酮對(duì)嗜酸乳桿菌SrtA酶活力的影響

分選酶進(jìn)行轉(zhuǎn)肽作用時(shí)不需要ATP的參與，因此在體外可以較為方便地測(cè)定Lap-SrtAΔN48的活性。利用帶有熒光基團(tuán)的底物肽Dabcyl-QALPTTGEE（Edans）測(cè)定SrtA的活性，Lap-SrtAΔN48切割熒光基團(tuán)結(jié)果如圖3所示。由于對(duì)照組沒(méi)有分選酶活性，在孵育過(guò)程中，熒光強(qiáng)度會(huì)衰減，因此相對(duì)酶活力呈負(fù)值，SrtA在37 ℃時(shí)可以成功切斷肽段LPTTG，使熒光基團(tuán)Edans發(fā)出熒光。

圖3 不同金屬離子對(duì)Lap-SrtAΔN48蛋白活性的影響Fig. 3 Effect of different metal ions on Lap-SrtAΔN48 activity

金屬離子是生命體不可缺少的微量元素，對(duì)酶的活力和機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育有著重要的影響。由圖3可知，Mg2＋、Mn2＋可顯著提高Lap-SrtAΔN48的活力（P＜0.05）；Zn2＋也可以提高Lap-SrtAΔN48的活力，但效果并不顯著（P＞0.05）；Ca2＋不會(huì)影響Lap-SrtAΔN48的活力（P＞0.05），明顯區(qū)別于其他SrtA酶。Ilangovan[3]、Li Hong’en[21]等在對(duì)金黃色葡萄球菌OS2分選酶（Sa-SrtA）及單核細(xì)胞性李斯特菌BUG1600分選酶（Lm-SrtA）的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Ca2＋可以提高Sa-SrtA及Lm-SrtA的活力至原來(lái)的4 倍以上。Naik等[22]研究了Sa-SrtAΔN59與Ca2＋的關(guān)系，結(jié)果表明，Sa-SrtA β6與β7之間的谷氨酸（Glu171）可以使Ca2＋結(jié)合到酶活中心附近，改變Sa-SrtA的動(dòng)力學(xué)結(jié)構(gòu)，提高Sa-SrtA的催化效率，而Lap-SrtAΔN48在這一區(qū)域并未發(fā)現(xiàn)功能相似的氨基酸（圖6）。

圖4 查爾酮對(duì)SrtA蛋白活性的抑制作用Fig. 4 Inhibitory activity of chalcone on SrtA

由圖4可知，查爾酮在體外可以顯著抑制Lap-SrtAΔN48的活性，抑制效果與查爾酮的濃度有關(guān)，濃度越高，查爾酮的抑制作用越強(qiáng)。結(jié)合以往的研究結(jié)果，查爾酮可以與熒光肽底物競(jìng)爭(zhēng)酶活位點(diǎn)，使Lap-SrtAΔN48喪失轉(zhuǎn)肽能力。

查爾酮是一種黃酮類(lèi)化合物，普遍存在于植物體內(nèi)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，查爾酮可以直接封閉蛋白酶的活性位點(diǎn)，阻止SrtA的轉(zhuǎn)肽作用，抑制Listeria monocytogenes、Streptococcus mutans、S. pyogenes[21,24]等多種致病菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附，具有良好的應(yīng)用前景。由于查爾酮有較高的廣譜抑制效果，本實(shí)驗(yàn)選擇它作為研究Lap-SrtAΔN48特性的工具。結(jié)果顯示，查爾酮同樣會(huì)抑制Lap-SrtAΔN48的活性，查爾酮特殊的分子結(jié)構(gòu)具有較大的柔性，如果人體腸道中其他益生菌的SrtA結(jié)構(gòu)與L. acidophilus ATCC4356相似，查爾酮就會(huì)干擾正常的腸道微生物環(huán)境，影響人體健康。查爾酮對(duì)多種SrtA的抑制效應(yīng)也表明，依靠特殊的分子結(jié)構(gòu)抑制SrtA酶活力的方法沒(méi)有特異性，因而在通過(guò)查爾酮阻止腸道致病菌對(duì)腸道的吸附作用進(jìn)行治療時(shí)，可能會(huì)影響人體內(nèi)原有的微生物，引發(fā)一定的副作用。

2.4 Lap-SrtAΔN48重組蛋白生物信息學(xué)分析

圖5 預(yù)測(cè)的Lap-SrtA三維結(jié)構(gòu)Fig. 5 Structure of Lap-SrtA predicted by SWISS MODEL

使用ExPASY在線(xiàn)檢測(cè)工具對(duì)Lap-SrtAΔN48分析后發(fā)現(xiàn)，Lap-SrtAΔN48總氨基酸數(shù)為181，分子質(zhì)量約為20 kDa，理論等電點(diǎn)為9.95，分子式為C891H1466N244O255S11，脂肪指數(shù)為85.14，不穩(wěn)定指數(shù)為23.95，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)（不穩(wěn)定指數(shù)大于40屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)）。SrtA屬于Ⅱ類(lèi)膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（N端位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，C端位于細(xì)胞膜外側(cè)），蛋白質(zhì)在細(xì)胞壁外側(cè)發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，Lap-SrtAΔN48中含有14.92%的α螺旋結(jié)構(gòu)和26.52%的β折疊結(jié)構(gòu)；可能存在11 個(gè)蛋白質(zhì)識(shí)別位點(diǎn)和1 個(gè)蛋白質(zhì)-核酸結(jié)合位點(diǎn)。SrtA可以催化多種表面蛋白，這些蛋白質(zhì)識(shí)別位點(diǎn)可能對(duì)應(yīng)的是不同的表面蛋白。

由圖5可知，采用SWISS MODEL構(gòu)建的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)顯示，Lap-SrtAΔN48由5 段α螺旋和8 段β折疊結(jié)構(gòu)組成，其中，8 條反向平行的β折疊形成了一個(gè)β中心桶狀結(jié)構(gòu)，與單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌的基本結(jié)構(gòu)相同。β中心桶狀結(jié)構(gòu)是SrtA的經(jīng)典結(jié)構(gòu)，是分選酶進(jìn)行轉(zhuǎn)肽作用的基礎(chǔ)，研究表明，位于β4、β7和β8上活性位點(diǎn)會(huì)形成一個(gè)口袋結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以識(shí)別表面蛋白的LPXTG序列，并攻擊T與G之間的肽鍵，催化轉(zhuǎn)肽過(guò)程（圖4）[25]。

圖6 Lap-SrtA蛋白與同源蛋白序列比對(duì)結(jié)果Fig. 6 Results of multiple sequence alignment of Lap-SrtA protein and homologous proteins

由圖6可知，以L(fǎng)m-SrtA為模板，將Lap-SrtAΔN48與其他革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌分選酶序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌SrtA之間有很高的同源性，并且均存在組氨酸（H）-半胱氨酸（C）-精氨酸（R）三聯(lián)體活性中心，這是SrtA的主要活性氨基酸，此外，組氨酸附近存在LAGH等保守序列，半胱氨酸附近也存在TLITC保守序列，可能與分選酶活性有關(guān)。結(jié)合序列比對(duì)結(jié)果，本研究推測(cè)Lap-SrtA活性氨基酸為His137、Cys198、Arg205。組氨酸和精氨酸是SrtA酶抓取LPXTG序列的必需氨基酸，而半胱氨酸可以將底物從TG之間切開(kāi)[26]。

3 討 論

分選酶錨定機(jī)制是細(xì)菌外蛋白的5 種錨定方式之一[27]，本研究利用大腸桿菌表達(dá)載體獲得了具有活性的Lap-SrtA蛋白，并對(duì)其分子生物學(xué)特性作了初步分析。

相較于Sa-SrtA、Lm-SrtA，Ca2＋不會(huì)影響Lap-SrtA的活性，氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Lap-SrtA在β6與β7之間沒(méi)有谷氨酸（Glu），這可能是Lap-SrtA對(duì)Ca2＋不敏感的原因之一。谷氨酸是Sa-SrtA結(jié)合Ca2＋的關(guān)鍵氨基酸 ，在Sa-SrtA催化轉(zhuǎn)肽作用時(shí)，Ca2＋可以同時(shí)結(jié)合β6/β7之間的谷氨酸和β3/β4之間天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸等氨基酸，拉近兩段肽鏈之間的距離，使Sa-SrtA的活性位點(diǎn)發(fā)生形變，提高催化效率。另外，金黃色葡萄球菌，單核細(xì)胞性李斯特菌均為致病菌，其分選酶及分選酶依賴(lài)蛋白多數(shù)為毒性蛋白，Sa-SrtA及Lm-SrtA對(duì)Ca2＋的敏感性很可能是為了適應(yīng)毒性蛋白的錨定而進(jìn)化的特殊性質(zhì)[22]。

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，Lap-SrtA的結(jié)構(gòu)和活性位點(diǎn)與Sa-SrtA、Sp-SrtA和Lm-SrtA相似，均由8條β折疊和若干α螺旋及部分β轉(zhuǎn)角組成；其中，位于β4、β7、β8上的組氨酸-半胱氨酸-精氨酸構(gòu)成了SrtA的三聯(lián)體活性中心。由于具有相似的結(jié)構(gòu)和相同的活性位點(diǎn)，查爾酮同樣可以抑制Lap-SrtA的活性。通過(guò)與Lap-SrtA的活性位點(diǎn)相結(jié)合，查爾酮可以阻止Lap-SrtA與底物蛋白間的相互作用，抑制Lap-SrtA的催化作用[24]。因此，查爾酮雖然對(duì)多種分選酶有抑制效果，但它也有一定的副作用，如果長(zhǎng)期作用于生物體，很可能會(huì)影響機(jī)體內(nèi)的正常菌群。鑒于查爾酮的廣譜抑制效應(yīng)，本研究認(rèn)為，以競(jìng)爭(zhēng)性抑制為原理篩得的SrtA抑制劑有一定的缺陷，針對(duì)致病菌分選酶抑制劑的開(kāi)發(fā)可以從它們對(duì)Ca2＋的敏感性入手，如果可以進(jìn)一步確定Ca2＋的作用機(jī)制，設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，降低SrtA與Ca2＋的相互作用，同樣可以有效抑制致病菌SrtA的活性，同時(shí)不影響嗜酸乳桿菌ATCC4356分選酶的正常功能。

乳酸菌必須定殖于人體腸道中才能發(fā)揮益生作用，因此，乳酸菌對(duì)腸道細(xì)胞的黏附被認(rèn)為是定殖的首要條件[28]。但是近年來(lái)不斷有研究顯示，目前的益生菌產(chǎn)品中的乳酸菌在腸道中的滯留能力并不理想。雖然乳酸菌可以耐受人體消化道嚴(yán)苛的環(huán)境，成功到達(dá)腸道，但它們大部分并不能成功定殖，多數(shù)外源乳酸菌在腸道內(nèi)存在時(shí)間很短，一旦停止從外界攝入，它們的數(shù)目會(huì)在2 周內(nèi)迅速衰減[29-30]。因此，提高乳酸菌的定殖能力一直是乳品研究者們努力的方向。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Lap-SrtA對(duì)Ca2＋不敏感，催化效率較低，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌表面黏附蛋白含量減少，對(duì)宿主細(xì)胞的黏附能力也會(huì)降低，因此，嗜酸乳桿菌在腸道中定殖成功率不高，很容易被其他腸道菌群排斥。目前，可以通過(guò)改變?nèi)樗峋呐囵B(yǎng)條件，篩選黏附性較強(qiáng)的乳酸菌菌種，改善乳酸菌在腸道中的定殖率；另一方面，通過(guò)分子生物學(xué)的方法增強(qiáng)乳酸菌分選酶的含量，進(jìn)而提高乳酸菌的黏附能力也是一個(gè)可行的方法。

分選酶雖然在多種乳酸菌中被發(fā)現(xiàn)，但它識(shí)別表面蛋白的種類(lèi)及底物識(shí)別機(jī)制尚不明確，SrtA在腸道環(huán)境中的催化效率、轉(zhuǎn)運(yùn)方式、相應(yīng)的激活劑及抑制劑等仍需要進(jìn)一步闡明。只有獲得這些酶更為詳細(xì)的信息，才能使乳酸菌及其制品獲得更好的應(yīng)用。

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