枸杞蜂花粉主要化學(xué)成分與抗氧化作用

周望庭，米 佳，祿 璐，羅 青，閆亞美,,* ，曹有龍,*，曾曉雄

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002）

蜂花粉是蜜蜂從植物中采集的花粉粒并注入花蜜和唾液而形成的顆粒團(tuán)狀物[1]，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被稱為天然的“微型營(yíng)養(yǎng)庫(kù)”[2]。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》就有有關(guān)蜂花粉的食用記載，服用“蒲黃”、“松黃”（即蜂花粉），具有延年益壽、增強(qiáng)體質(zhì)等功效[3]。研究表明，蜂花粉具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等生物活性[4-7]。

枸杞是一種藥食同源的植物，其根、莖、葉、果實(shí)均可入藥，具有較高的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[8]。我國(guó)西北部地區(qū)盛產(chǎn)枸杞，其中以寧夏地區(qū)出產(chǎn)的枸杞最為著名。我國(guó)也是世界上的養(yǎng)蜂大國(guó)，每年采集的蜂花粉產(chǎn)量大，閆亞美等[9]報(bào)道我國(guó)每年潛在的枸杞蜂花粉量可超過(guò)12萬(wàn) t，其中寧夏每年可生產(chǎn)約5萬(wàn) t的枸杞蜂花粉。由于蜂花粉具有優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)特性且資源豐富，具有潛在的開發(fā)與利用價(jià)值。目前關(guān)于枸杞蜂花粉的研究主要集中在多酚和黃酮方面，冉林武等[10]用超聲波法提取并測(cè)定了枸杞蜂花粉中黃酮的含量，結(jié)果表明枸杞蜂花粉中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.03%；李紅兵等[11]對(duì)枸杞蜂花粉等6 種蜂花粉總酚含量進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)油菜花粉中總酚含量最高，枸杞蜂花粉中含量次之；唐琳等[12]對(duì)21 種蜂花粉水提物的抗氧化效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)枸杞蜂花粉水提物對(duì)羥自由基具有較強(qiáng)的清除作用；楚元奎等[13]研究了枸杞蜂花粉水提物、醇提物對(duì)丙酸睪酮復(fù)制的大鼠前列腺增生的抑制作用，結(jié)果表明枸杞蜂花粉水提物具有一定的抑制前列腺增生作用。而目前關(guān)于枸杞蜂花粉中其他成分的種類及含量少見(jiàn)報(bào)道，因此本研究采用分光光度法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupled plasma atomic emission spectrometry， ICP-AES）法對(duì)枸杞蜂花粉中的主要化學(xué)成分進(jìn)行了分析，同時(shí)利用體外抗氧化方法對(duì)枸杞蜂花粉的抗氧化效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，旨在為枸杞蜂花粉的深加工與應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞蜂花粉收集于寧夏銀川市園林場(chǎng)枸杞基地。

葡萄糖、果糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；牛血清蛋白 北京Solarbio公司；16 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、沒(méi)食子酸、蘆丁 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；12 種礦物元素標(biāo)準(zhǔn)品溶液 國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；甲醇、乙腈（色譜純） 江蘇漢邦科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AY120萬(wàn)分之一天平、LC-20A HPLC儀（蒸發(fā)光散射檢測(cè)器） 日本島津公司；X0-650E超聲波細(xì)胞破碎機(jī)南京先歐儀器制造有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀東京理化器械有限公司；LyoQuest冷凍干燥機(jī) 西班牙Telstar公司；V-1200型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；1100 HPLC儀（二極管陣列檢測(cè)器）美國(guó)安捷倫公司；Kjeltec 2300全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；ETHOS ONE微波消解儀 意大利Milestone公司；Optima 2100DV ICP-AES 美國(guó)Perkin Elmer公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞蜂花粉中可溶性總糖、游離單糖和雙糖含量的測(cè)定

可溶性總糖含量的測(cè)定參照陳鈞輝等[14]報(bào)道的蒽酮比色法。游離單糖和雙糖含量的測(cè)定參照葛菁等[15]報(bào)道的HPLC法并作一定的改進(jìn)。取0.1 g枸杞蜂花粉，加入10 mL 80%乙醇溶液，80 ℃提取1 h，離心取上清液并定容至25 mL；取1 mL樣液過(guò)0.45 μm的濾膜，待用。HPLC檢測(cè)條件：流動(dòng)相：75%乙腈；流速：1 mL/min；色譜柱：Asahipak NH2P-50 4E氨基柱；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；檢測(cè)時(shí)間：15 min。

1.3.2 枸杞蜂花粉中蛋白質(zhì)、游離氨基酸含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量采用自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定，游離氨基酸含量的測(cè)定參照Wang Lin等[16]報(bào)道的OPA柱前衍生法進(jìn)行。

1.3.3 枸杞蜂花粉中總多酚、總黃酮含量的測(cè)定

總多酚、總黃酮含量的測(cè)定參照董捷等[17]報(bào)道的福林-酚法、亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法進(jìn)行。

1.3.4 枸杞蜂花粉中礦物元素含量的測(cè)定

枸杞蜂花粉中礦物元素含量的測(cè)定參照趙立艷等[18]報(bào)道的方法并作適當(dāng)?shù)男薷?。ICP-AES儀器工作條件：入射功率：1.3 kW；霧化器流量：0.8 L/min；輔助氣流量：0.2 L/min；冷卻氣流量：15 L/min；樣品提升量：1.5 mL/min；觀測(cè)方向：軸向；檢測(cè)器：CCD檢測(cè)器。

1.3.5 枸杞蜂花粉的水提物、水提醇沉上清物及粗多糖的制備

枸杞蜂花粉水提物的制備：稱取25 g枸杞蜂花粉，加入500 mL去離子水，85 ℃提取3 h，離心取上清液，提取2 次；合并上清液，濃縮、凍干即得蜂花粉水提物（F1）。

枸杞蜂花粉水提醇沉上清物、粗多糖的制備：依上述方法得到上清液，濃縮，加入4 倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃放置過(guò)夜，離心并分離得到上清液和沉淀；上清液濃縮并凍干即得到水提醇沉上清物（F2），沉淀用去離子水復(fù)溶，透析、凍干即可得粗多糖（F3）。

1.3.6 枸杞蜂花粉的抗氧化效果評(píng)價(jià)

參照Yuan Qingxia[19]、Xie Minhao[20]等報(bào)道的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除法、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt cation radical，ABTS＋·）清除法、超氧陰離子自由基清除法、金屬離子螯合能力法評(píng)價(jià)枸杞蜂花粉的抗氧化效果，其中將F1、F2、F3配制成質(zhì)量濃度為0.125～4 mg/mL的溶液。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞蜂花粉中可溶性總糖、游離單糖和雙糖的含量

蜂花粉中可溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.8%，這與荷花蜂花粉總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（41.45%）[21]相近，比糯玉米蜂花粉總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（24.53%）[22]、黑松蜂花粉總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（8.52%）[23]高，表明枸杞蜂花粉含有很高的碳水化合物含量。

圖1 枸杞蜂花粉中可溶性糖HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatogram of soluble sugars in Chinese wolfberry bee pollen

從圖1可以看出，枸杞蜂花粉中含有果糖、葡萄糖、蔗糖3 種游離糖，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18.4%、15.2%、3.7%，其總和可達(dá)37.3%，說(shuō)明枸杞蜂花粉中的碳水化合物主要以可溶性的游離單糖與雙糖的形式存在，也從側(cè)面反映出枸杞蜂花粉中還含有適量的多糖，枸杞蜂花粉多糖可能是枸杞蜂花粉具有某些生物功能的基礎(chǔ)。

2.2 枸杞蜂花粉中蛋白質(zhì)、游離氨基酸的含量

從表1可以看出，枸杞蜂花粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.0%。張金振等[24]測(cè)定了13 種植物源蜂花粉蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果顯示茶花蜂花粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（29.0%），蕎麥蜂花粉中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低（14.3%），而枸杞蜂花粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（25.0%）與茶樹蜂花粉相近，表明枸杞蜂花粉可作為一種豐富的蛋白質(zhì)來(lái)源。

圖2 枸杞蜂花粉中游離氨基酸HPLC圖Fig. 2 HPLC chromatograms of free amino acids in Chinese wolfberry bee pollen

表1 枸杞蜂花粉中蛋白質(zhì)、游離氨基酸含量Table1 Contents of proteins and free amino acids in Chinese wolfberry bee pollen

由圖2和表1可知，HPLC法檢測(cè)到枸杞蜂花粉中含有13 種游離氨基酸，其中谷氨酸（Glu）的含量最高，丙氨酸（Ala）、天冬酰胺（Asn）含量次之，亮氨酸（Leu）含量最低?？傆坞x氨基酸含量約占枸杞蜂花粉干質(zhì)量的0.25%，與Paramas等[25]報(bào)道的32 種西班牙蜂花粉平均游離氨基酸含量（3.09%）相比，枸杞蜂花粉游離氨基酸總含量較低。此外在測(cè)定出的13 種游離氨基酸中，含有6 種必需氨基酸，分別為色氨酸（Trp）、蘇氨酸（Thr）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、賴氨酸（Lys），僅占總游離氨基酸含量的15.9%。因此，枸杞蜂花粉中雖含有較多的游離氨基酸種類，但缺少了2 種人體必需氨基酸，且必需氨基酸含量不高，所以在開發(fā)利用枸杞蜂花粉中游離氨基酸時(shí)，需作出必要的調(diào)整與補(bǔ)充。

2.3 枸杞蜂花粉中總多酚、總黃酮的含量

枸杞蜂花粉中含有豐富的酚類物質(zhì)，總多酚含量為22.95 mg/g（以沒(méi)食子酸當(dāng)量計(jì)，下同），總黃酮含量為21.17 mg/g（以蘆丁當(dāng)量計(jì)，下同），與李紅兵等[11]報(bào)道的枸杞蜂花粉總多酚和總黃酮含量接近。枸杞蜂花粉中總酚含量與Blaise等[26]測(cè)定的絲蘭蜂花粉（19.48 mg/g）相近，比含羞草蜂花粉總酚含量（34.85 mg/g）低，比Sladana等[27]測(cè)定的7 種玉米蜂花粉總酚含量（平均值為8.90 mg/g）高。比董捷等[17]測(cè)定的黃玫瑰等10 種蜂花粉總黃酮含量都高。由于枸杞蜂花粉含有較高的多酚含量，可為枸杞蜂花粉在美容養(yǎng)顏、延緩衰老等保健功能上提供一定的應(yīng)用基礎(chǔ)與指導(dǎo)作用。

2.4 枸杞蜂花粉中礦物元素的含量

蜂花粉中含有種類眾多的礦物元素，如表2所示，枸杞蜂花粉12 種礦物元素總含量為16.183 mg/g；在常量元素K、Ca、Na、Mg、P中，P元素含量最高，為6.962 mg/g，Na元素含量最低，為0.294 mg/g；在微量元素中，Zn元素含量最高，可達(dá)0.043 2 mg/g，Pb元素含量最低，為0.002 8 mg/g。

表2 枸杞蜂花粉中礦物元素的含量Table2 Contents of mineral elements in Chinese wolfberry bee pollen

不同地區(qū)、品種的花粉之間礦物元素含量有著一定的差別。就Zn元素的含量而言，Sattler等[28]報(bào)道巴西蜂花粉礦物元素中Zn元素含量為0.035 μg/mg；楊開等[29]測(cè)定的12 種國(guó)內(nèi)蜂花粉中，Zn元素含量也各不相同，最低為野菊花蜂花粉（0.028 μg/mg），最高為茶花蜂花粉（0.065 μg/mg）。由于枸杞蜂花粉中含有眾多的礦物元素，特別是其中含有較高的Zn元素含量，賦予了枸杞蜂花粉很好的保健功效。

2.5 枸杞蜂花粉的抗氧化作用

2.5.1 枸杞蜂花粉的DPPH自由基及超氧陰離子自由基清除活性

如圖3所示，F(xiàn)1、F2、F3對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除效果與它們的質(zhì)量濃度均呈量效關(guān)系，隨著質(zhì)量濃度的增加，清除自由基活性增強(qiáng)。三者對(duì)DPPH自由基清除率的IC50值分別為0.634、0.569、2.297 mg/mL，F(xiàn)1、F2對(duì)超氧陰離子自由基清除率的IC50值分別為0.131、0.061 mg/mL。

圖3 枸杞蜂花粉的DPPH自由基（A）和超氧陰離子自由基（B）清除活性Fig. 3 Scavenging activities of Chinese wolfberry bee pollen on DPPH (A) and superoxide anion (B) radicals

當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，F(xiàn)1、F2、F3和VC對(duì)DPPH自由基的清除率可分別達(dá)到84.72%、86.63%、65.82%和90.34%，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率可分別達(dá)到74.78%、79.45%、39.43%和84.35%。其中F1、F2對(duì)DPPH自由基最高清除率無(wú)顯著差異，與F3、VC對(duì)DPPH自由基最高清除率具有顯著性差異；四者對(duì)超氧陰離子自由基最高清除率均具有顯著性差異。同時(shí)，當(dāng)F1、F2的質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL以上時(shí)，對(duì)這2 種自由基的清除率均達(dá)到50%以上，并隨著質(zhì)量濃度的升高與VC的清除效果越接近，呈現(xiàn)出很高的抗氧化作用；而F3對(duì)DPPH自由基的IC50為2.297 mg/mL，對(duì)超氧陰離子自由基清除率不超過(guò)50%（最高為40.17%），表明F3具有一定的抗氧化效果。另外，從圖3可以看出，隨著質(zhì)量濃度的升高，自由基清除活性呈現(xiàn)出F2＞F1＞F3的趨勢(shì)。

通過(guò)福林-酚法測(cè)定F1、F2、F3中多酚的含量，結(jié)果表明多酚含量F2（77.12 mg/g）＞F1（66.28 mg/g）＞F3（6.01 mg/g）。由于F2、F1中含有較高的多酚含量，所以其抗氧化活性均高于F3；而F3中多酚含量較少，但由于F3主要成分是多糖，是一種多羥基化合物，具有一定的供氫能力，可起到抗氧化作用，所以F3也具有一定的抗氧化活性。

2.5.2 枸杞蜂花粉的ABTS＋·清除活性及金屬離子螯合能力

圖4 枸杞蜂花粉的ABTS＋·清除活性（A）和金屬離子螯合活性（B）Fig. 4 ABTS+· radical scavenging activity (A) and metal iron chelating ability(B) of Chinese wolfberry bee pollen

如圖4A所示，隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，F(xiàn)1、F2、F3對(duì)ABTS＋·的清除活性也隨之增強(qiáng)，三者的IC50值分別為約為0.434、0.374、0.895 mg/mL。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，F(xiàn)1、F2、F3對(duì)ABTS＋·清除率分別可達(dá)99.02%、99.17%、98.67%，與VC對(duì)ABTS＋·最高清除率（99.41%）無(wú)顯著性差異，表明三者均具有顯著的ABTS＋·清除作用。

如圖4B所示，F(xiàn)1、F2、F3對(duì)Fe2＋的螯合率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而上升，其中F1、F3對(duì)金屬離子螯合能力的IC50值分別為0.908、0.229 mg/mL。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，F(xiàn)1、F2、F3和EDTA對(duì)Fe2＋的最高螯合率分別可達(dá)到62.43%、45.30%、78.43%和99.37%，四者均具有顯著性差異。另外，與上述三者對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、ABTS＋·清除活性趨勢(shì)不同的是，F(xiàn)3的金屬螯合作用比F1、F2的金屬螯合作用強(qiáng)。由于抗氧化劑的金屬螯合能力與其擁有的功能基團(tuán)如—SH、—COOH、—OH、—NR2、C＝O、—O—、—PO3H2—等[30]有關(guān)，而F3中以多糖為主（其糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68.14%），且通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定F1、F2、F3中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.60%、2.15%、15.78%，故推測(cè)F3對(duì)Fe2＋螯合活性較高的原因與其中含有的多糖和蛋白質(zhì)含量、種類及其基團(tuán)有關(guān)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以枸杞蜂花粉為原料，通過(guò)分光光度法、HPLC法、ICP-AES法測(cè)定了其中可溶性總糖、游離單糖與雙糖、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、總多酚、總黃酮、礦物元素的含量。結(jié)果顯示，枸杞蜂花粉中可溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.8%，果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18.4%、15.2%、3.7%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.0%，總游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%（共13 種氨基酸，6 種必需氨基酸）；總多酚、總黃酮含量分別為22.95、21.17 mg/g，礦物元素總含量為16.183 mg/g。

通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，從枸杞蜂花粉水提物（F1）、水提醇沉上清物（F2）、粗多糖（F3）3 個(gè)層面評(píng)價(jià)枸杞蜂花粉的抗氧化效果。結(jié)果表明，枸杞蜂花粉具有顯著的抗氧化作用，其中抗氧化效果為F2＞F1＞F3。

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