痞痛舒降低內(nèi)臟高敏感治療功能性消化不良的研究

智屹惠沈煒王坤根林友寶黃立權(quán)沈淑華孫潔蔡利軍

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院杭州310006 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是指存在一種或多種消化不良癥狀，經(jīng)檢查可排除引起上述癥狀的器質(zhì)性疾病的一組臨床綜合征[1]。根據(jù)羅馬Ⅲ的診斷標(biāo)準(zhǔn)，西方國家FD的人群發(fā)病率高達(dá)11%，我國發(fā)病率為23.5%[2]。雖然FD不威脅患者生命，但嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，每年耗費大量的醫(yī)療資源[3]。由于FD患者在治療過程中容易出現(xiàn)安慰劑效應(yīng)，因此現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的療效并不令人滿意。

現(xiàn)有研究表明，內(nèi)臟高敏感是FD發(fā)病的重要機制[4]。肥大細(xì)胞（mast cells，MC）活化與內(nèi)臟高敏感的外周致敏機制關(guān)系密切，而c-fos基因表達(dá)增加和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）磷酸化水平增高對于內(nèi)臟高敏感的中樞敏感化形成至關(guān)重要[5]。痞痛舒是導(dǎo)師王坤根治療FD的經(jīng)驗方，由柴胡、白芍、蒼術(shù)、厚樸、元胡、甘草組成，具有良好的臨床療效。筆者前期動物實驗發(fā)現(xiàn)，痞痛舒能夠促進小鼠胃排空、增強胃腸動力。本研究擬對FD大鼠模型給予痞痛舒治療，觀察其對胃黏膜組織MC活化、脊髓背角c-fos基因和蛋白表達(dá)及對ERK磷酸化水平的影響，來探討痞痛舒治療FD的部分可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 10d齡清潔級SD大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量約20g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司 [許可證號：SCXK(滬)2012-0002]，20d 齡前母乳喂養(yǎng)，20d齡開始予常規(guī)飼料喂養(yǎng)。所有大鼠均飼養(yǎng)于杭州赫貝屏障級動物實驗中心的獨立通氣籠具（individual ventilated cages，IVE）中[許可證號：SYXK（浙）2012-0178]。相對濕度50%～70%，溫度（22±1）℃，12h明暗交替，換風(fēng)次數(shù) 15～20 次/h，噪音低于50dB。

1.2 主要藥品和試劑 痞痛舒（柴胡、白芍、蒼術(shù)、厚樸、元胡、甘草）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室提供，用8倍量純化水煎煮兩次，每次1h，合并濾液，常壓濃縮至每毫升含生藥材2g，制成痞痛舒流浸膏備用。c-fos抗體購于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司（批號：GR27488），工作濃度 1:300；兔抗羊二抗購于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司（批號：GR1878-25），工作濃度1:500；p44/42絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs）（ERK1/2）兔單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司（批號：4695S）；磷酸化 p44/42 MAPK（ERK1/2）兔單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司（批號：4377S）；羊抗兔IgG（H+L）HRP購于美國Bioworld Technology 公司 （批號：BS13278）；RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit購于加拿大Fermentas公司（批號：00161002）；qPCR 試劑 SuperReal Premix Plux（with SYBR Green I）購于天根生化科技(北京)有限公司（批號：#N2217）；ECL Plus發(fā)光試劑盒（批號：1408105）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，批號：1407230）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：0580582）均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；碘乙酰胺購于上海紫一試劑廠（批號：ZY140215）；DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（批號：K146708C）；DNA/RNA/蛋白共提取試劑盒為美國Omega Bio-Tek公司產(chǎn)品（貨號：R6734-01；批號：00R6734010000A23N018）；彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購于加拿大Fermentas公司；PVDF膜購于美國Millipore公司。

1.3 主要儀器 BL-420F機能實驗系統(tǒng)購于成都泰盟科技有限公司；乳膠氣囊（2.5cm×2.0cm）和聚乙烯導(dǎo)管 （10.0cm×0.2cm） 為自制；Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)購于美國Bio-RAD公司；SPECTRA max Plus 384酶標(biāo)儀購于美國Molecular Devices公司；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDoC XRS+）購于美國Bio-RAD公司；tec 2500型病理組織漂烘儀為常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；H1650R臺式高速冷凍離心機購于上海盧湘儀離心機儀器有限公司；BX43型顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 造模 簡單隨機法選取80只10d齡乳大鼠造模，每只乳大鼠予0.2mL含0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液灌胃，1次/d，連續(xù)6d。另外20只作為正常對照組，予等體積2%蔗糖溶液灌胃，1次/d。所有大鼠常規(guī)喂養(yǎng)至第 56 日[5]。

1.4.2 分組與給藥 第57日時，將造模大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、痞痛舒高劑量組、痞痛舒中劑量組、痞痛舒低劑量組。自第57日起，按照大鼠體表面積系數(shù)，將痞痛舒臨床劑量換算為等效劑量：痞痛舒低劑量組按生藥量228mg/（kg·d）劑量予痞痛舒流浸膏灌胃，中劑量組按325mg/（kg·d）劑量灌胃，高劑量組按464mg/（kg·d）劑量灌胃。正常對照組及模型組予等體積的純化水灌胃。連續(xù)給藥28d后檢測指標(biāo)。給藥第28日,每組各隨機選取6只大鼠檢測胃肌電圖（electromyography，EMG），剩余大鼠斷頭法處死后按要求獲取標(biāo)本。

1.4.3 EMG檢測 大鼠術(shù)前禁食不禁水過夜，第2日在無菌條件下進行所有手術(shù)操作。大鼠仰臥固定，予80mg·kg-1氯胺酮和7mg·kg-1甲苯噻嗪腹腔注射麻醉，從胃底作一切口，植入一個帶導(dǎo)管的乳膠球囊（球囊長2.5cm），球囊位置應(yīng)不阻塞幽門，且不妨礙胃排空。緊密縫合切口以防止胃液進入腹腔，然后逐層縫合腹腔和皮膚。將球囊的充氣導(dǎo)管和EMG電極導(dǎo)線一起外置于大鼠頸背部，以絕緣的40號聚四氟乙烯無菌不銹鋼線置入斜方肌，肌肉和切口以4-0絲線縫合。術(shù)后1周，將上述大鼠分別置于塑料大鼠限制籠中適應(yīng)1h，球囊導(dǎo)管與血壓計連接，20s內(nèi)向球囊注氣，使胃內(nèi)壓達(dá)到40mmHg，休息5min后行EMG檢測。EMG基線信號以及胃恒壓擴張時的EMG信號由低噪音的AC放大器擴增，使用CED 1401/SPIKE2程序數(shù)字化并集成。

1.4.4 胃組織HE染色 大鼠快速斷頭法處死，迅速切取近端胃，用0.9%氯化鈉溶液沖去粘附的分泌物及血液，福爾馬林固定，制作石蠟切片。切片脫蠟復(fù)水后行HE染色，脫水透明，中性樹膠封固，200倍光鏡下觀察形態(tài)學(xué)結(jié)果。

1.4.5 胃組織甲苯胺藍(lán)染色 標(biāo)本處理及石蠟切片制作同1.4.4項。切片脫蠟復(fù)水后1%甲苯胺藍(lán)染液染色30min，水洗，冰醋酸分化，直至細(xì)胞核和顆粒清晰。水洗后冷風(fēng)吹干；透明后中性樹膠封固。200倍光鏡下每張切片隨機選擇3個不同視野，對胃組織MC進行計數(shù)，結(jié)果以每高倍視野MC個數(shù)表示。

1.4.6 免疫組化檢測大鼠脊髓背角c-fos蛋白表達(dá)情況 大鼠快速斷頭法處死，小心取出T8-9脊髓，迅速切取脊髓背角，沿中線分成兩份，一部分福爾馬林固定，制作石蠟切片，其余部分于-80℃冰箱保存，準(zhǔn)備行Western blot和Real-time RT-PCR檢測。切片脫蠟復(fù)水后，37℃下加入3%H2O2孵育10min，微波修復(fù)，一抗4℃冰箱孵育過夜（磷酸鹽緩沖液為陰性對照），室溫平衡30min后加入二抗，37℃孵育 30min，DAB顯色，顯微鏡下觀察。自來水充分沖洗，蘇木素染液復(fù)染，干燥后封片并拍照。200倍光鏡下觀察，每張切片隨機選擇3個不同的視野，判讀視野中陽性細(xì)胞染色強度和陽性細(xì)胞百分比。染色強度的最終計分為大部分細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強度計分減去背景著色計分：0分為無明顯著色，1分為輕微黃色或淡黃色，2分為棕黃色或深黃色，3分為黑褐色或棕褐色。陽性細(xì)胞百分比=每視野陽性細(xì)胞數(shù)/每視野細(xì)胞總數(shù)×100%，陽性細(xì)胞百分比最終計分如下：0～5%為0分，6%～25%為 1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%均為4分。染色結(jié)果判定采用半定量方法，陽性得分為染色強度計分與陽性細(xì)胞百分比計分的乘積：0分為陰性，1～6分為弱陽性，7～12分為強陽性。

1.4.7 Real-time RT-PCR檢測大鼠脊髓背角c-fos mRNA表達(dá)情況 大鼠脊髓標(biāo)本采集和處理同1.4.6項。DNA/RNA/蛋白共提取試劑盒提取組織總RNA；測定RNA純度并判斷質(zhì)量；cDNA合成，-20℃保存?zhèn)溆?。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。大鼠c-fos正向引物：5’-GAAGGAAAGGAATAA-3’；反向：5’-TTGGCAATCTCGGTCT-3’。內(nèi)參序列：大鼠Actin正向引物：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，反向：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。 反 應(yīng) 體 系 ：IQ SYBR Green Supermix 10μL、10μmol·L-1正向引物 1 μL、10μmol·L-1反向引物 1μL、cDNA（加水稀釋成一致水平）8μL。反應(yīng)參數(shù)：50℃ 3min；95℃ 15min；95℃10s；54℃ 20s；70℃ 15s。模板變形、退火、延伸重復(fù) 40個循環(huán)。熔解溫度：70℃～95℃。mRNA相對表達(dá)量計算采用比較Ct值法（2-△△Ct法），由熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager自動進行計算和統(tǒng)計。

1.4.8 Western blot檢測大鼠脊髓背角ERK1/2與磷酸化 ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，pERK1/2）蛋白表達(dá) 標(biāo)本采集和處理同1.4.6項。取適量組織勻漿，PMSF裂解液提取總蛋白，置于-80℃保存；BCA法測定蛋白濃度；配制10%分離膠和5%濃縮膠，上樣量為每泳道30μg，電泳轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉室溫封閉過夜；一抗室溫孵育2h；二抗室溫孵育1h；化學(xué)光敏模式曝光顯影；Image J軟件分析照片中各條帶的光密度。ERK1/2磷酸化水平以pERK1/2與ERK1/2的比值表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，組間兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD-t）進行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠一般情況 造模初期，正常對照組乳大鼠因灌胃死亡3只，造模的80只中因灌胃死亡18只。最終正常對照組存活大鼠17只，模型組和痞痛舒低劑量組各15只，痞痛舒中、高劑量組各16只，各組存活大鼠生長良好，反應(yīng)靈敏。造模后各組大鼠自發(fā)活動增多，進食減少，但組間體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。痞痛舒給藥期間各組大鼠未發(fā)生死亡，給藥后各組大鼠體質(zhì)量增加，給藥結(jié)束后各組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 大鼠FD模型的建立 在40mmHg胃擴張壓力下，模型組大鼠EMG的振幅較正常對照組增加。見圖1。HE染色顯示，正常對照組胃組織無炎癥改變，而模型組胃黏膜可見輕度慢性炎癥改變。見圖2。本研究采用碘乙酰胺法建立FD大鼠模型，與文獻報道一致[6]。碘乙酰胺可以引起乳鼠成年后內(nèi)臟高敏感，而胃黏膜組織僅有輕度慢性炎癥改變，上述結(jié)果說明大鼠FD模型建立成功。

圖1 40mmHg壓力擴張后大鼠EMGFig.1 The gastric electromyography when expansion pressure was 40mmHg

圖2 大鼠胃組織炎癥情況（HE染色，200×）Fig.2 Inflammation of gastric tissue in rats(HE staining,200×）

2.3 各組大鼠胃組織MC觀察與計數(shù) 胃組織甲苯胺藍(lán)染色顯示，正常對照組MC主要分布在黏膜下層，肌層及黏膜層未見；模型組除黏膜下層外，肌層亦可見較多的MC。痞痛舒各劑量組肌層、黏膜下層可見少量MC。其中，痞痛舒高劑量組和中劑量組部分視野黏膜下層仍可見較多的MC。MC計數(shù)：模型組MC數(shù)量明顯高于正常對照組（P＜0.05）。痞痛舒各劑量組與模型組相比較，MC數(shù)明顯減少（P＜0.05）；痞痛舒各劑量組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1、圖 3。

表1 各組大鼠胃組織MC觀察與計數(shù)(±s，n=6)Tab.1 Observation and counting of mast cells in gastric mucosa of rats in each group(±s，n=6)

表1 各組大鼠胃組織MC觀察與計數(shù)(±s，n=6)Tab.1 Observation and counting of mast cells in gastric mucosa of rats in each group(±s，n=6)

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05.

圖3 各組大鼠胃組織MC觀察（甲苯胺藍(lán)染色，200×）Fig.3 Observation of gastric tissue MC by light microscope(toluidine blue staining,200×)

2.4 免疫組化檢測各組大鼠脊髓背角c-fos蛋白表達(dá)水平 模型組脊髓背角c-fos陽性得分明顯高于正常對照組（P＜0.05）；痞痛舒各劑量組c-fos陽性得分均低于模型組，其中痞痛舒高劑量組與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而痞痛舒中、低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。痞痛舒各劑量組組間比較，差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 2、圖 4。

表2 各組大鼠脊髓背角c-fos蛋白表達(dá)水平(±s，n=6)Tab.2 Expression of c-fos protein in dorsal horn of spinal cord in rats(±s，n=6)

表2 各組大鼠脊髓背角c-fos蛋白表達(dá)水平(±s，n=6)Tab.2 Expression of c-fos protein in dorsal horn of spinal cord in rats(±s，n=6)

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05.

圖4 各組大鼠脊髓背角c-fos蛋白表達(dá)（免疫組化，200×）Fig.4 Expression of c-fos protein in dorsal horn of spinal cord in rats(Immunohistochemistry,200×)

2.5 Real time RT-PCR檢測各組大鼠脊髓背角cfos mRNA表達(dá)水平 模型組脊髓背角c-fos mRNA相對表達(dá)量高于正常對照組（P＜0.05）。痞痛舒各劑量組中，低劑量組c-fos mRNA相對表達(dá)量與模型組相近，而中、高劑量組c-fos mRNA相對表達(dá)量明顯低于模型組和低劑量組（P＜0.05）。正常對照組與痞痛舒中、高劑量組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠脊髓背角c-fos mRNA表達(dá)水平(±s，n=6)Tab.3 Expression of c-fos mRNA in dorsal horn of spinal cord in rats(±s，n=6)

表3 各組大鼠脊髓背角c-fos mRNA表達(dá)水平(±s，n=6)Tab.3 Expression of c-fos mRNA in dorsal horn of spinal cord in rats(±s，n=6)

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與痞痛舒低劑量組比較，△P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with Pitongshu low dose group,△P＜0.05.

2.6 Western blot檢測各組大鼠脊髓背角ERK1/2與磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá) 各組間ERK1/2蛋白表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。正常對照組ERK1/2磷酸化水平（pERK1/2與ERK1/2的比值）與模型組、痞痛舒低劑量組無明顯差異（P＞0.05），痞痛舒中、高劑量組ERK1/2磷酸化水平低于低劑量組、正常對照組與模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但痞痛舒中、高劑量組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5及表4。

圖5 各組大鼠脊髓背角ERK1/2與pERK1/2蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of ERK and pERK1/2 protein in dorsal horn of spinal cord in rats

表4 各組大鼠脊髓背角ERK1/2蛋白磷酸化水平(±s，n=6)Tab.4 The phosphorylation of ERK1/2 protein in spinal dorsal horn in rats(±s，n=6)

表4 各組大鼠脊髓背角ERK1/2蛋白磷酸化水平(±s，n=6)Tab.4 The phosphorylation of ERK1/2 protein in spinal dorsal horn in rats(±s，n=6)

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與痞痛舒低劑量組比較，△P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with Pitongshu low dose group,△P＜0.05.

3 討論

FD的主要病理機制為胃腸動力障礙和內(nèi)臟高敏感[4]。內(nèi)臟高敏感通常表現(xiàn)為腸道對化學(xué)性刺激以及機械擴張閾值降低[7]。內(nèi)臟高敏感包括外周致敏和中樞致敏兩方面機制，主要表現(xiàn)為外周和中樞神經(jīng)元的自發(fā)性活性增強，興奮性提高[8]。

MC在內(nèi)臟高敏感的外周致敏機制中有重要的作用。人胃腸道黏膜中的MC有47%～77%與神經(jīng)纖維伴行。受到外界刺激或者感染的情況下，MC被激活，發(fā)生脫顆粒，釋放多種因子，如組胺、一氧化氮（nitric oxide，NO）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、類胰蛋白酶等。其中組胺、NO等作用于胃腸平滑肌受體，導(dǎo)致胃腸道功能紊亂；5-HT、類胰蛋白酶作用于胃黏膜初級神經(jīng)末梢受體，使胃腸道與中樞神經(jīng)投射敏感性增加，從而產(chǎn)生內(nèi)臟高敏感[9]。研究證實，減低黏膜MC數(shù)量并抑制其脫顆粒，可改善患者早飽、餐后不適、上腹痛、上腹燒灼感等癥狀[10]。所以，本實驗選用MC作為觀察內(nèi)臟高敏感的外周致敏機制的主要指標(biāo)。

中樞致敏機制被認(rèn)為是內(nèi)臟高敏感的關(guān)鍵因素。c-fos是原癌基因，參與細(xì)胞生長和生化調(diào)節(jié)。其基礎(chǔ)表達(dá)非常低，但受到刺激后c-fos基因可在幾分鐘之內(nèi)被激活，轉(zhuǎn)錄為mRNA，30min內(nèi)達(dá)到高峰，而c-fos蛋白的表達(dá)大大延遲，刺激后30min才開始表達(dá)[5]。c-fos在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著第三信使的作用[11]，被認(rèn)為是各種刺激的共同效應(yīng)因子，也在神經(jīng)可塑性和記憶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化中起著重要的作用，被常用作為神經(jīng)元功能-形態(tài)的標(biāo)志。

ERK1/2是MAPKs中的一種，參與將細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)，如cfos、c-Jun等。pERK是磷酸化的ERK，通過信號級聯(lián)通路Ras-Raf-MEK-ERK途徑激活，其表達(dá)水平可代表ERK1/2通路的激活程度。近年研究發(fā)現(xiàn)ERK參與神經(jīng)可塑性改變和痛覺過敏。pERK可被作為神經(jīng)元傷害刺激后的活動標(biāo)志物。與c-fos表達(dá)相比較，受到刺激后pERK表達(dá)更為迅速，1min內(nèi)開始增加，2～5min 表達(dá)達(dá)到高峰[5]。

脊髓背角是內(nèi)臟感覺的關(guān)鍵部位，會聚內(nèi)臟感覺傳入神經(jīng)[12]，也是中樞神經(jīng)下行調(diào)節(jié)的通路。慢性有害性內(nèi)臟刺激可使脊髓背角神經(jīng)元發(fā)生可塑性改變，神經(jīng)元興奮性持續(xù)存在，這一點被認(rèn)為是內(nèi)臟高敏感的中樞致敏機制的中心環(huán)節(jié)[13]。所以，本實驗選用脊髓背角的c-fos及其上游的ERK1/2磷酸化水平作為內(nèi)臟高敏感的中樞致敏機制的主要觀察指標(biāo)。

痞痛舒是導(dǎo)師王坤根總結(jié)其50余年臨床經(jīng)驗提煉出的治療FD的基本方。王師認(rèn)為FD的病位主要涉及脾胃、肝膽，其基本病機是肝氣郁結(jié)，脾胃升降失常，進而發(fā)展為濕阻、熱郁，久病多入絡(luò)，傷陰耗氣。治療以疏肝和胃，運脾化濕為大法。痞痛舒方中柴胡、白芍疏肝柔肝為君；蒼術(shù)、厚樸行氣燥濕為臣；元胡行氣活血止痛為佐，可助柴胡行氣，白芍止痛；甘草調(diào)和諸藥為使，合白芍既可酸甘化陰，防止疏泄太過，又可緩急止痛。本方辛散與酸收并用，益肝之體而疏肝之用，辛開苦降，斡旋中州氣機。因久痛入絡(luò)，故方中用行氣活血之品；因脾虛濕阻，更以運脾化濕和胃安中諸藥相伍，二和木土，則“痞”、“痛”自除。驗之于臨床，效如桴鼓。現(xiàn)代藥理研究表明：痞痛舒方中的柴胡可明顯延長熱致痛小鼠熱痛反應(yīng)時間,顯著拮抗醋酸所致的疼痛，柴胡皂苷可增強兔離體腸管蠕動[14]。白芍中的芍藥苷能夠減低大鼠各種傷害感受和過敏反應(yīng)[15]。蒼術(shù)中的β-桉葉醇在胃腸運動功能正?；虻拖聲r，能促進胃腸運動[16]。厚樸可使兔離體胃底條平滑肌的張力明顯升高，對乙酰膽堿所致的十二指腸平滑肌蠕動加強有明顯拮抗作用[17]。延胡索的有效成分左旋延胡索乙素對神經(jīng)痛有很強的鎮(zhèn)痛效果[18]，延胡索全堿能抑制胃酸分泌量及胃酸酸度，具有抗?jié)冏饔肹19]。此外，總芍藥苷具有抗抑郁的作用[15]，而延胡索具有抗焦慮的作用[20]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為FD的發(fā)病與精神因素有關(guān)[21]，而筆者也認(rèn)為FD的基本病機是肝氣郁結(jié)，這也可能是痞痛舒的作用機制之一。

本研究中模型組的MC計數(shù)明顯高于對照組，痞痛舒各劑量組胃黏膜的MC要低于模型組，說明痞痛舒能抑制胃組織中的MC數(shù)量，提示其治療FD可能是通過內(nèi)臟高敏感的外周機制起到作用。本研究還發(fā)現(xiàn)模型組脊髓背角的c-fos蛋白、c-fos mRNA均高于對照組，提示模型組存在中樞致敏；痞痛舒高劑量組c-fos蛋白的表達(dá)低于模型組,痞痛舒中、高劑量組c-fos mRNA的表達(dá)及ERK1/2磷酸化水平均低于模型組及痞痛舒低劑量組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。提示痞痛舒治療FD可能主要是通過內(nèi)臟高敏感的中樞機制起到作用，并且提示痞痛舒的作用可能存在一定的量效關(guān)系。臨床上患者服用的痞痛舒通常采用常規(guī)劑量，本研究的結(jié)果為臨床上痞痛舒的劑量調(diào)整提供了一定的依據(jù)，但仍然需要對不同劑量的痞痛舒進行毒理學(xué)研究進一步證實。

綜上所述，本研究提示痞痛舒治療FD存在雙重機制，既可以通過減少胃黏膜MC數(shù)量，減低末梢神經(jīng)刺激這一外周機制，又可以通過抑制c-fos表達(dá)及pERK磷酸化，降低中樞敏感這一中樞機制。痞痛舒通過兩條途徑降低內(nèi)臟高敏感，達(dá)到治療FD的效果，且可能存在一定的量效關(guān)系。

[1]Tack J,Talley N J,Camilleri M,et al.Functional gastroduodenal disorders[J].Gastroenterology,2006,130(5)：1466-1479.

[2]吳柏瑤，張法燦，梁列新.功能性消化不良的流行病學(xué)[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22(1):85-90. WU Boyao,ZHANG Facan,LIANG Liexin.Epidemiology of functional dyspepsia[J].Chinese Journal of Gastroenterolog and Hepatology,2013,22(1):85-90.

[3]Lacy B E,Talley N J,Camilleri M.Functional dyspepsia:time to change clinical trial design[J].Am J Gastroenterol,2010,105(12):2525-2529.

[4]Miwa H,Watari J,Fukui H,et al.Current understanding of pathogenesis of functional dyspepsia[J].J Gastroenterol Hepatol,2011.26(Suppl 3):53-60.

[5]Gao Y J,Ji R R.C-Fos and pERK,which is a better marker forneuronalactivation and centralsensitization after noxious stimulation and tissue injury[J].Open Pain J,2009,2(1):11-17.

[6]Liu L S,Winston J H,Shenoy M M,et al.A rat model of chronic gastric sensorimotordysfunction resulting from transient neonatal gastric irritation[J].Gastroenterology,2008,134(7):2070-2079.

[7]陳磊，陳莉麗，全俊，等.腸易激綜合征與功能性消化不良重疊的治療進展[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2014，23(3):350-352.CHEN Lei,CHEN Lili,QUAN Jun,et al.Treatment progress of overlap between irritable bowel syndrome and functional dyspepsia[J].Chinese Journal of Gastroenterology and Hepotology,2014,23(3):350-352.

[8]鄒多武，許國銘.內(nèi)臟高敏感在功能性胃腸病中的作用[J].胃腸病學(xué)，2006，11(8):451-453.ZOU Duowu, XU Guoming.The role of visceral hypersensitivity in functional gastrointestinal diseases[J].Chinese Journal of Gastroenterology,2006,11(8):451-453.

[9]張明明，吳璐一，張淑靜，等.肥大細(xì)胞在內(nèi)臟高敏感發(fā)生及針灸治療中的作用[J].山西中醫(yī)，2013，29(4):57-60.ZHANG Mingming,WU Luyi,ZHANG Shujing,et al.The role of mast cells in the pathogenesis of visceral hypersensitivity and in the treatment of acupuncture[J].Shanxi Journal of Traditional Chinese Medicine,2013,29(4):57-60.

[10]董洪娟，徐曉明，余澤波.半夏瀉心湯對功能性消化不良患者胃黏膜肥大細(xì)胞及血漿胃動素的影響 [J].海南醫(yī)學(xué)，2017，28(4):566-568.DONG Hongjuan,XU Xiaoming,YU Zebo.Clinical effect ofPinelliae Decoction forPurging Stomach-Fire on gastric mucosal mast cells and plasma motilin in patients with functional dyspepsia[J].Hainan Medical Journal,2017,28(4):566-568.

[11]Schbitz W R,Schade H,Heiland S,et al.Neuroprotection by hyperbaric oxygenation after experimental focal cerebral ischemia monitored by MRI[J].Stroke,2004,35(5):1175-1179

[12]唐慶林，宮秀群，馮根寶，等.腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟高敏感性與腦腸互動的研究[J].東南國防醫(yī)藥，2012，14(1):1-4.TANG Qinglin,GONG Xiuqun,FENG Genbao,et al.The investigation of the relation between visceral hypersensitivity and brain-gut interaction in the rat model with irritable bowel syndrome[J].Military Medical Journal of Southeast China,2012,14(1):1-4.

[13]楊敏，陳東風(fēng).內(nèi)臟高敏感性-中樞敏感化機制的研究進展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2009，38(15):1958-1960.YANG Min,CHEN Dongfeng.Research progress on the mechanism of visceral hypersensitivity-central sensitization[J].Chongqing Medicine,2009,38(15):1958-1960.

[14]陳亞雙，孫世偉.柴胡的化學(xué)成份及藥理作用研究進展[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，27(3):630-633.CHEN Yashuang,SUN Shiwei.Research progresson chemical constituents and pharmacological effects of Bupleurum[J].Heilongjiang Medicine Journal,2014,27(3):630-633.

[15]鞏向丹，張葉，劉宏明.白芍的研究概況[J].藥學(xué)研究，2014，33(9):531-534.GONG Xiangdan,ZHANG Ye,LIU Hongming.Research progress of Paeoniae Radix Alba[J].Journalof Pharmaceutical Research,2014,33(9):531-534.

[16]鄧愛平，李穎，吳志濤，等.蒼術(shù)化學(xué)成分和藥理的研究進展[J].中國中藥雜志，2016，41(21):3904-3913.DENG Aiping,LI Ying,WU Zhitao,et al.Advances in studies on chemical compositions of Atractylodes Lancea and their biological activities[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2016,41(21):3904-3913.

[17]李棣華.厚樸研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，14(9):220-222.LI Dihua.The research progress of Magnolia Officinalis Cortex[J].Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,2012,14(9):220-222.

[18]Guo Z,Man Ye,Wang X,et al.Levo-tetrahydropalmatine attenuates oxaliplatin-induced mechanical hyperalgesia in mice[J].Sci Rep,2014,4(1):3905-3908.

[19]施婷婷，韓麗姝，李希，等.元胡止痛方有效組分不同配伍對大鼠胃潰瘍的保護作用[J].中國臨床藥學(xué)雜志，2015，24(3):141-147.SHI Tingting,HAN Lishu,LI Xi,et al.Effect of active componentsofYuanhu Zhitongcompound atdifferent match pair on gastric ulcer in rats[J].Chinese Journal of Clinical Pharmacy,2015,24(3):141-147.

[20]龍全江，徐雪琴，王曉閣.延胡索化學(xué)成分、藥理作用與產(chǎn)地加工技術(shù)研究概況[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，31(5):78-80.LONG Quanjiang,XU Xueqin,WANG Xiaoge.A research overview of chemical composition,pharmacological effects and production technology of Corydalis[J].Journal of Gansu College of Traditional Chinese Medicine,2014,31(5):78-80.

[21]郭蘭潔，吳光輝.功能性消化不良的精神心理因素分析[J].臨床醫(yī)藥實踐，2015，24(11):864-865.GUO Lanjie,WU Guanghui.Theanalysison mental psychological factors of functional dyspepsia[J].Proceeding of Clinical Medicine,2015,24(11):864-865.