單增李斯特菌與細(xì)胞焦亡

李鈺心 賈艷艷 原 維

（1.鄭州外國語新楓楊學(xué)校，河南鄭州 450001；2.河南科技大學(xué)動物疾病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽 471023；3.浙江伊科拜克動物保健品有限公司，浙江湖州 313220）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種宿主譜廣泛的兼性胞內(nèi)菌，在自然界中廣泛存在，LM能穿過人體及動物的腸道、血腦和胎盤三大屏障，引起人、羊、豬及雞等發(fā)生李斯特菌病[1]。人畜感染后常表現(xiàn)為腦膜炎、胃腸炎、流產(chǎn)等癥狀，該病病死率高達(dá)30%以上，具有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義[2]。美國每年李斯特菌污染造成近2500人患病，神經(jīng)系統(tǒng)感染者死亡率在30%以上[3]。而我國從1964年到2010年報(bào)道李斯特菌病案例，臨床病例病死率為26%[4]。因此，單增李斯特菌不僅造成大批動物死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失，同時(shí)對人類及動物健康存在巨大的潛在威脅。

1 LM的感染過程

單增李斯特菌進(jìn)入機(jī)體后，可以感染多種細(xì)胞，如肝細(xì)胞等非吞噬細(xì)胞，及巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）等。在宿主細(xì)胞中，單增李斯特菌能夠分泌毒力因子李斯特菌溶胞素（Listeriolysin O，LLO）和磷脂酶去裂解吞噬體膜，從而使單增李斯特菌逃入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。一旦進(jìn)入胞質(zhì)，單增李斯特菌開始快速增殖，并啟動肌動蛋白聚合酶A（ActA）的表達(dá)，ActA聚合宿主細(xì)胞的肌動蛋白，形成彗星狀的肌動蛋白尾，驅(qū)使單增李斯特菌在胞質(zhì)內(nèi)運(yùn)動，進(jìn)而感染相鄰細(xì)胞[5-6]。

2 細(xì)胞焦亡

2.1 細(xì)胞焦亡的概述

細(xì)胞死亡是貫穿于所有生命活動的一種現(xiàn)象，在機(jī)體新陳代謝的生理過程和病理過程中均有重要作用，充分認(rèn)識細(xì)胞死亡的現(xiàn)象和本質(zhì)具有十分重要的生物學(xué)意義。細(xì)胞死亡方式分為程序性死亡和被動性死亡。前者需要代謝能量，由特定的細(xì)胞信號和效應(yīng)分子介導(dǎo)，后者由外力失控誘導(dǎo)。程序性死亡包括凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）及焦亡（pyroptosis）等，被動性死亡包括壞死（necrosis）[7]。其中，細(xì)胞焦亡是一種新的促炎程序性細(xì)胞死亡模式，由半胱天冬蛋白酶1（caspase-1）依賴性介導(dǎo)，同時(shí)伴有大量促炎因子的釋放，誘發(fā)級聯(lián)放大的炎癥性反應(yīng)，已成為研究病原與宿主細(xì)胞互作的熱點(diǎn)之一[8]。

圖1 細(xì)胞焦亡的炎癥性過程

2.2 細(xì)胞焦亡的形態(tài)特征

焦亡細(xì)胞的最顯著特征是細(xì)胞膜完整性喪失和胞內(nèi)容物釋放，誘發(fā)級聯(lián)炎癥性反應(yīng)。研究表明細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)細(xì)胞膜有1～2 nm的小孔形成，這些小孔使細(xì)胞內(nèi)的離子平衡喪失，水分內(nèi)流，細(xì)胞腫脹繼而膜破裂，最終細(xì)胞發(fā)生滲透性溶解[9]。

2.3 細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制

細(xì)胞焦亡發(fā)生的主要機(jī)制是內(nèi)源性及外源性刺激信號通過不同途徑作用于炎性體（inflammasome）而激活caspase-1，介導(dǎo)細(xì)胞滲透性腫脹破裂，形成細(xì)胞膜小孔，胞內(nèi)內(nèi)容物流出，IL-1β、IL-18前體裂解并誘導(dǎo)其他炎性因子等的合成和釋放，從而放大局部和全身炎癥反應(yīng)[10]。研究證明，caspase-1的活化是由多蛋白復(fù)合物炎性體所介導(dǎo)的，炎性體將caspase-1前體裂解成具有活性的caspase-1，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β和IL-18前體形成成熟的細(xì)胞因子，引起細(xì)胞焦亡[11]。

炎性體通常是含NACHT（nucleotide binding oligomerization domain）、LRR（leucine rich repeat）和PYD（pyrin domain）結(jié)構(gòu)域的蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing a CARD，ASC）和caspase-1前體所構(gòu)成的多蛋白復(fù)合物。接頭蛋白ASC含有CARD（caspase activation and recruitment domain）和PYD結(jié)構(gòu)域，通過CARD-CARD和PYDPYD相互作用結(jié)合，能夠作為雙重接頭蛋白分子將炎性體與caspase-1以橋梁形式連接起來，將二聚體形式的caspase-1前體裂解為p10、p20的兩個(gè)大小亞基，最后形成具有催化活性的caspase-1，作用于IL-1β和IL-18前體，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。炎性體由相關(guān)病原體分子模式（如細(xì)菌毒素、病毒、寄生蟲）和內(nèi)源性危險(xiǎn)相關(guān)分子模式（如透明質(zhì)酸）所觸發(fā)。NOD樣受體（nod-like receptors，NLRs）包含NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRC5、PYRIN（pyrin and HIN domain-containing protein）和AIM2（absent inmelanoma 2）是炎性體家族的主要成員，在炎癥反應(yīng)發(fā)生和維持中起重要作用[12-13]。

研究表明，細(xì)胞焦亡廣泛參與感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和動脈粥樣硬化性疾病等的發(fā)生發(fā)展，并在這些疾病中發(fā)揮重要作用[14]。

3 LM感染過程中誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡

LM誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答依賴于多種受體的識別，如細(xì)胞表面的Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）[15]、胞漿識別的NOD受體。胞外LM主要被TLR2和TLR5所識別，而NOD1及NOD2識別胞漿中的LM。最新研究發(fā)現(xiàn)胞漿的LM可被NLRs中的NLRC4、NLRP3及AIM2等識別，其中NLRC4主要識別細(xì)菌鞭毛及Ⅲ型分泌蛋白，NLRP3則主要識別破壞的溶酶體，AIM2識別胞漿中細(xì)菌裂解后釋放的DNA[16]。一旦被激活，這些受體組裝形成炎性體，從而招募procaspase-1并經(jīng)切割形成活性狀態(tài)caspase-1，后者剪切前IL-1β和前IL-18，最終形成IL-1β和IL-18，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡（pyroptosis）。

研究報(bào)道，LM能夠激活巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體及caspase-1的活化，釋放IL-1β家族的促炎性因子，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生促炎性死亡，從而清除胞內(nèi)LM及實(shí)現(xiàn)宿主防御[17]。Wu等研究顯示NLRP3及ASC參與LM誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生caspase-1依賴型細(xì)胞促炎性死亡，且TLR4信號通路在NLRP3炎性體激活中發(fā)揮作用，說明LM引發(fā)NLRP3炎性體的激活有多條信號通路的參與[18]。Witte報(bào)道炎性體通路是LM感染過程中引發(fā)的天然免疫機(jī)制之一[19]。Sauer等構(gòu)建了表達(dá)鞭毛蛋白的重組LM菌株，作為NLRP4炎性體增強(qiáng)型菌株，免疫小鼠后減弱了機(jī)體T細(xì)胞應(yīng)答能力，并降低了對小鼠的免疫保護(hù)力，提示炎性體的激活可改變LM菌株的特異性免疫應(yīng)答[20]。上述研究表明病原體感染機(jī)體時(shí)細(xì)胞焦亡可作為一種宿主防御機(jī)制，然而細(xì)胞焦亡的過度激活亦可造成機(jī)體損害。因此，炎性體的激活及細(xì)胞焦亡在宿主抵御LM入侵及LM的致病機(jī)制中具有重要意義。

4 結(jié)語

細(xì)胞焦亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種炎癥性程序性細(xì)胞死亡模式，可被多種體內(nèi)外刺激信號所觸發(fā)，其中炎性體的激活活化是細(xì)胞焦亡過程的關(guān)鍵。目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡及炎性體激活在機(jī)體抵御病原微生物感染過程中發(fā)揮著先天免疫的作用，在LM感染宿主細(xì)胞的過程中，可激活機(jī)體細(xì)胞中的不同炎性體，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，改變機(jī)體的免疫應(yīng)答，進(jìn)而遏制細(xì)菌的感染。因此，深入研究單增李斯特菌誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡及炎性體激活的過程，有助于認(rèn)識細(xì)胞焦亡在李斯特菌病發(fā)生發(fā)展中的作用，為李斯特菌病的臨床防治提供全新的藥物靶點(diǎn)。

[1] 江玲麗，高有領(lǐng)，周向陽，等.單增李斯特菌膜裂解相關(guān)基因缺失突變株的構(gòu)建及生物學(xué)特性鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，47（4）：779-788.

[2] Shan Y，F(xiàn)ang C，Cheng C，et al. Immersion infection of germ-free zebrafish with Listeria monocytogenes induces transient expression of innate immune response genes[J]. Front Microbiol，2015，（6）：373.

[3] Papandreou A，Hedrera-Fernandez A，Kaliakatsos M，et al.An unusual presentation of paediatric Listeria meningitis with selective spinal grey matter involvement and acute demyelinating polyneuropathy[J]. Eur J Paediatr Neurol，2016，20（1）：196-199.

[4] Feng Y，Wu S，Varma JK，et al. Systematic review of human listeriosis in China，1964-2010[J]. Trop Med Int Health，2013，18（10）：1248-1256.

[5] Freitag NE，Port GC，Miner MD. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen[J]. Nat Rev Microbiol. 2009，7（9）：623-628.

[6] Wood LM，Paterson Y. Attenuated Listeria monocytogenes：a powerful and versatile vector for the future of tumor immunotherapy[J].Front Cell Infect Microbiol. 2014，12（4）：51.

[7] 陳瑜，李艷，余赟，等.細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制及其在感染性疾病中的作用[J].中國病原生物學(xué)雜志，2017，12（2）：185-188.

[8] Bergsbaken T，F(xiàn)ink SL，Cookson BT. Pyroptosis：host cell death and inflammation[J].Nat Rev Microbiol.，2009，7（2）：99-109.

[9] 林靜，李大主.細(xì)胞焦亡：一種新的細(xì)胞死亡方式[J].國際免疫學(xué)雜志，2011，34（3）：213-216.

[10] Danthi P. Viruses and the Diversity of Cell Death[J]. Annu Rev Virol.2016，3（1）：533-553.

[11] 楊斯迪，鄧奇峰，黃瑞，等.炎性小體激活與細(xì)胞焦亡的研究進(jìn)展[J].微生物與感染，2017，12（3）：192-196.

[12] Man SM，Kanneganti TD. Regulation of inflammasome activation[J].Immunol Rev.，2015，265（1）：6-21.

[13] 祁會麗，姚麗芬.細(xì)胞焦亡激活機(jī)制及相關(guān)疾病研究進(jìn)展[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志，2016，30（5）：417-419.

[14] Man SM，Karki R，Kanneganti TD. Molecular mechanisms and functions of pyroptosis，inflammatory caspases and inflammasomes in infectious diseases[J].Immunol Rev，2017，277（1）：61-75.

[15] Regan T，Naly K，Carmody R，et al. Identification of TLR10 as a key mediator of the inflammatory response to Listeria monocytogenes in intestinal epithelial cells and macrophages[J]. J Immunol，2013，191（12）：6084-6092.

[16] Wu J，F(xiàn)ernandes-Alnemri T，Alnemri E S. Involvement of the AIM2，NLRC4，and NLRP3 Inflammasomes in Caspase-1 Activation by Listeria monocytogenes[J].J Clin Immunol，2010，30（5）：693-702.

[17] Kim S，Bauernfeind F，Ablasser A，et al. Listeria monocytogenes is sensed by the NLRP3 and AIM2 inflammasome[J]. Eur J Immunol，2010，40（6）：1545-1551.

[18] Wu J，F(xiàn)ernandes-Alnemri T，Alnemri ES. Involvement of the AIM2，NLRC4，and NLRP3 inflammasomes in caspase-1 activation by Listeria monocytogenes[J].J Clin Immunol，2010，30（5）：693-702.

[19] Witte CE，Archer KA，Rae CS，et al. Innate immune pathways triggered by Listeria monocytogenes and their role in the induction of cell-mediated immunity[J].Adv Immunol，2012，（113）：135-156.

[20] Williams CR，Dustin ML，Sauer JD. Inflammasome-mediated inhibition of Listeria monocytogenes-stimulated immunity is independent of myelomonocytic function[J].PLoS One，2013，8（12）：e83191.