基于代謝網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的杜仲治療皮膚光老化的靶向研究

孫琪　祁永華　吳迪等

[摘要]目的：利用代謝網(wǎng)絡(luò)技術(shù)研究杜仲治療大鼠皮膚光老化的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)。方法：采用經(jīng)典的皮膚光老化動(dòng)物模型制備方法，參考臨床生化指標(biāo)對(duì)所建立的模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，判定模型組大鼠皮膚老化程度，采用無(wú)歧視的代謝網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)對(duì)大鼠的尿液樣本進(jìn)行全局分析，聚焦關(guān)鍵代謝通路和作用靶點(diǎn)。結(jié)果：形態(tài)學(xué)考察發(fā)現(xiàn)其具有典型的皮膚光老化特征。皮膚組織的各項(xiàng)指標(biāo)均顯示模型組大鼠機(jī)體發(fā)生的顯著地氧化受損過(guò)程，給予杜仲后出現(xiàn)一定回調(diào)趨勢(shì)。尿液代謝軌跡分析發(fā)現(xiàn)杜仲具有顯著回調(diào)皮膚光老化的作用。進(jìn)一步聚焦分析發(fā)現(xiàn)皮膚光老化大鼠的代謝主要集中在花生四烯酸代謝和谷胱甘肽代謝通路，谷胱甘肽過(guò)氧化酶可能是其潛在的作用靶點(diǎn)。結(jié)論：杜仲對(duì)由紫外光照射誘導(dǎo)的皮膚光老化大鼠模型具有很好的回調(diào)作用，谷胱甘肽代謝是其涉及的核心代謝通路，谷胱甘肽過(guò)氧化酶為其潛在的作用靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]杜仲；紫外光；光老化；代謝組學(xué)；谷胱甘肽

[中圖分類號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）08-0070-03

杜仲（Codex Eucomnna）為杜仲科植物杜仲（Euconunia ulmides Oliv）干燥莖皮，杜仲在我國(guó)已有2000多年的藥用歷史?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將杜仲列為上品，杜仲是名貴滋補(bǔ)藥材，具有補(bǔ)中益精氣、強(qiáng)筋骨、強(qiáng)志、安胎、久服輕身耐老之功效。本研究依托藥效學(xué)及代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)皮膚光老化大鼠的代謝機(jī)制和杜仲干預(yù)皮膚光老化大鼠的作用機(jī)制進(jìn)行研究，為杜仲防治皮膚光老化及延緩衰老作用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1儀器及試劑：AB SCIEX Triple Quad^TM3500（美國(guó)AB SCIEX公司）；XPE105分析天平（瑞士梅特勒托利多）；RT-9000半自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)雷杜公司）；紫外線照射儀（無(wú)錫四聯(lián)公司）；紫外線輻照器（北京師范大學(xué)光電儀器廠）；VDUPL超純水機(jī)（九方沃德科技有限公司）；羥脯氨酸（HYP）試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（中生北控生物工程研究所、20160911、20160806和20160890）。杜仲購(gòu)自貴州貴陽(yáng)市，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)陳孝忠副教授鑒定為杜仲科杜仲屬杜仲的干燥樹皮。

1.2動(dòng)物及光老化動(dòng)物模型制備：Sprague-Dawley（SD）大鼠雌雄各半，體重（150±10）g。黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲食飲水。剔除大鼠背部毛發(fā)，紫外光局部照射處理復(fù)制大鼠光老化模型。18只健康SD大鼠按體重隨機(jī)分為3組，分別為空白組、模型組和給藥組。大鼠麻醉取背部皮膚，置紫外光下30cm處，給予20min紫外線照射，OVA劑量為70J/cm²，隔日給予，共計(jì)3h。空白組背部剃毛處理、無(wú)紫外光照射處理。給藥組灌胃給予800mg/kg杜仲提取液溶液，連續(xù)18d，模型組給予等量生理鹽水。

1.3口服溶液制備：杜仲藥材提取液溶于蒸餾水中制成0.1g/ml的灌胃溶液。

1.4生物樣本的采集及制備：實(shí)驗(yàn)第19天早各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予烏拉坦腹腔注射麻醉后，采集背部皮膚組織樣本，面積約1cm×1cm背部皮膚組織，制備成皮膚組織勻漿液，分別取10μl、100μl和100μl，依據(jù)相應(yīng)試劑盒使用說(shuō)明方法用于皮膚組織T-SOD、N）A、HYP含量測(cè)定。模型制備過(guò)程中隔天早8點(diǎn)開始收集12h尿液，并離心（4℃、11000rpm/min、12min），取上清液置于-80℃環(huán)境下保存，尿液代謝樣本采取原尿液與水1：4比例混溶，離心（4℃、11000rpm/min、12min），過(guò)0.22μm濾膜作為供試品溶液。

色譜柱：ACQUITY UPLC^TMHSS T3（100mm×2.1mm i.d.，1.8μm）（Waters集團(tuán)公司，美國(guó)）；流動(dòng)相A0.1%的甲酸乙腈溶液，流動(dòng)相B0.1%的甲酸水溶液；柱溫35℃；流速0.4ml/min；進(jìn)樣量2μl；梯度洗脫方法見表1。

離子噴霧電壓：6KV；離子源溫度：500℃；碰撞能量（CE）：30eV；氮?dú)鉃殪F化氣和輔助氣：霧化氣55psi，輔助氣55 psi。質(zhì)量范圍為全掃描，積累時(shí)間250ms。工作站為Analyst TF 1.6軟件。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS18.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)組間生化指標(biāo)進(jìn)行分析，TTEST值小于0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采用AB公司分析軟件Peak View對(duì)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行模式識(shí)別分析SIMCA 11.5（瑞典Umetrics公司），以正交偏最小二乘判別分析篩選尿液潛在生物標(biāo)記物。

2結(jié)果

2.1生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果：與空白組相比，模型組大鼠皮膚組織中的T-SOD活性明顯降低，具有顯著性差異（P<0.05），MDA含量顯著升高，具有極顯著性差異（P<0.01），光老化大鼠皮膚中羥脯氨酸HYP含量顯著減少，具有極顯著性差異（P<0.01），給予杜仲提取液后，呈回調(diào)趨勢(shì)。見表2。

2.2尿液代謝組學(xué)研究結(jié)果：光老化多維數(shù)如圖1所示，對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別分析以篩選潛在生物標(biāo)記物。如圖2所示，空白組和模型組兩組分離明顯，給藥組代謝輪廓處于空白組和模型組間，且部分給藥組與空白組重合，證明給藥組的代謝整體向健康狀態(tài)發(fā)展，杜仲對(duì)紫外照射的皮膚光老化有很好的治療作用。進(jìn)一步通過(guò)模式識(shí)別技術(shù)篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的小分子代謝產(chǎn)物。同時(shí)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，共鑒定出皮膚光老化尿液潛核心生物標(biāo)記物6個(gè)（圖3～4），分別是氧化谷胱甘肽（Glutathione disulfide）、L-氨基酸（L-Amino acid）、雙γ-谷氨酰胱氨（Bis-gamma-glutamylcystine）、甘氨酸（Glycine）、O-磷酸-L-氨酸（O-Phospho-L-serine）、L-氨酸（L-Serine），其中主要代謝物，如氧化谷胱甘肽的代謝網(wǎng)絡(luò)示意圖如圖5所示。

3討論

皮膚老化是影響生活質(zhì)量和威脅人類健康的疾病之一，對(duì)其科學(xué)預(yù)防和治療刻不容緩。目前市場(chǎng)上針對(duì)皮膚老化問(wèn)題推出了一系列產(chǎn)品，其美容養(yǎng)顏功效只停留在表層，未能達(dá)到從機(jī)體代謝角度回調(diào)皮膚老化的目的。目前對(duì)皮膚老化的研究大多集中在細(xì)胞模型和動(dòng)物模型的特定指標(biāo)分析，未能從機(jī)體代謝的全局角度考慮皮膚老化的發(fā)病機(jī)制。故本實(shí)驗(yàn)采用系統(tǒng)生物學(xué)的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)皮膚老化大鼠的終端代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面分析，試圖從代謝角度對(duì)其進(jìn)行闡述。

前期研究表明，機(jī)體在長(zhǎng)期或大劑量紫外光照射時(shí)會(huì)應(yīng)激性的產(chǎn)生大量抗氧化酶，以對(duì)自身產(chǎn)生保護(hù)作用，同時(shí)也會(huì)大量消耗還原性代謝酶（如谷胱甘肽過(guò)氧化酶等）。損傷的皮膚抗氧化防御體系會(huì)產(chǎn)生更多的ROS，反作用于機(jī)體，加劇皮膚損傷的進(jìn)程，最終導(dǎo)致皮膚組織細(xì)胞皺縮、老化，出現(xiàn)組織形態(tài)學(xué)改變。

隨著系統(tǒng)生物學(xué)理論的完善和分析技術(shù)的快速發(fā)展，作為組學(xué)技術(shù)的最新分支代謝組學(xué)技術(shù)因其與中醫(yī)藥整體性理論的一致性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)癥候及中藥方劑的機(jī)理研究中，采用經(jīng)典的診斷指標(biāo)對(duì)所建立的模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定所建立模型的可靠性，進(jìn)而采用無(wú)損的尿液代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究，是目前中醫(yī)藥代謝組學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)化流程。本研究基于前期實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)檢索基礎(chǔ)，采用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)模型組大鼠的尿液進(jìn)行全面分析，通過(guò)代謝網(wǎng)絡(luò)技術(shù)獲取生物學(xué)信息。本次通過(guò)MS/MS技術(shù)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)分析共鑒定了由紫外光誘導(dǎo)的皮膚光老化潛在生物標(biāo)記物6個(gè)，通過(guò)聚焦分析發(fā)現(xiàn)其置于參與谷胱甘肽代謝通路，這與之前的研究報(bào)道有很大的相關(guān)性，通過(guò)杜仲提取物的干預(yù)后有明顯回調(diào)趨勢(shì)，證明此代謝可能為其潛在的作用靶點(diǎn)，同時(shí)為其發(fā)病機(jī)制和杜仲治療作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。endprint