氧化苦參堿對神經(jīng)病理性疼痛大鼠實時步態(tài)行為學(xué)的影響*

王鑫蕊 楊 麗，2△ 徐榕雪

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)省部共建中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110847；2.大連理工大學(xué)化工與環(huán)境生命學(xué)部制藥科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024；3.遼寧省本溪市金山醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 本溪 117000）

神經(jīng)病理性疼痛是指因末梢神經(jīng)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害或疾病導(dǎo)致的痛覺過敏、痛覺異常，如坐骨神經(jīng)痛、糖尿病性神經(jīng)病變等引起的疼痛。這種疼痛在損傷痊愈后的數(shù)月至數(shù)年仍可持續(xù)存在［1-4］。近年來的研究表明，疼痛信號先激活外周感受器，引起動作電位進(jìn)入DRG感覺神經(jīng)元，從而引起膜去極化，激活電壓依賴性鈣通道（VGCCs）［5］。 VGCCs 分為低電壓依賴性鈣通道和高電壓依賴性鈣通道（HVDCCs）［6］。 其中 HVDCCs分為 L-型、N-型、P/Q-型及 R-型。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿可以顯著提高經(jīng)過部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎且鞘內(nèi)注射L-型鈣通道阻斷劑硝苯地平的小鼠模型的機(jī)械縮足反應(yīng)閾值ED50［7］，且Nowycky等［8］研究發(fā)現(xiàn)在小雞的背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元中，3種鈣通道共存，L-型鈣通道能持久強力的去極化。因此本研究選擇L-型鈣通道阻斷劑硝苯地平，利用Cat Walk步態(tài)分析操作系統(tǒng)考察氧化苦參堿及L-型鈣通道阻滯藥對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型步態(tài)行為的影響。Cat Walk步態(tài)分析操作系統(tǒng)是定量分析嚙齒類動物模型腳步和步態(tài)的完整系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用于評估神經(jīng)性疼痛、脊髓損傷及恢復(fù)情況等，可直接檢測到坐骨神經(jīng)功能指數(shù)以及步態(tài)、足印等指標(biāo)，借助計算機(jī)分析，闡明神經(jīng)病理性疼痛大鼠行進(jìn)行為的改變及硝苯地平對氧化苦參堿改善神經(jīng)病理性疼痛大鼠的影響。同時，本研究將為拓展神經(jīng)病理性疼痛大鼠的行為評價指標(biāo)提供可靠依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只SD大鼠，體質(zhì)量為（200±20）g，雌性。由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXK（遼）2015-0001。所有動物實驗均按照遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理條例施行。

1.2 試藥與儀器 氧化苦參堿（純度為99.01%，批號：150416，成都普菲德生物技術(shù)有限公司），稱取0.105 g氧化苦參堿溶于10 mL的0.9%氯化鈉注射液中，配成質(zhì)量濃度為10.5 mg/mL的氧化苦參堿；硝苯地平（SLBD7789V，Sigma公司），稱取 0.008 g硝苯地平溶于10 mL的乙醇中，配成質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的硝苯地平。水合氯醛（批號：20110401，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（批號：12082104，沈陽志鷹制藥廠）；乙醇（批號：20141224，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。CatWalk XT 10.6動物步態(tài)采集分析系統(tǒng)（Noldus公司，荷蘭）。

1.3 分組與造模 將50只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、氧化苦參堿組、硝苯地平組和聯(lián)合

給藥組各10只，分籠飼養(yǎng)。參照Kim等［9］造模方法，建立脊神經(jīng)結(jié)扎（SNL）模型。大鼠稱體質(zhì)量后，經(jīng)10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔麻醉，置于俯臥位，腰部備皮，鈍性分離左側(cè)椎旁肌肉，暴露L5和L6神經(jīng)，用6號絲線緊緊結(jié)扎神經(jīng)后止血、縫合，并肌肉注射青霉素預(yù)防感染。 參照姜靜、吳世星等［7，10］前期研究中實驗動物給藥劑量換算關(guān)系，氧化苦參堿按照150 mg/kg體質(zhì)量的給藥劑量、硝苯地平按照11.5 mg/kg體質(zhì)量的給藥劑量對部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎小鼠的神經(jīng)病理性疼痛模型具有較強的抑制疼痛效果，因此本實驗中各給藥組大鼠按照1 mL/100 g體質(zhì)量分別注射相應(yīng)藥物。氧化苦參堿組腹腔注射質(zhì)量濃度為10.5 mg/mL的氧化苦參堿，硝苯地平組腹腔注射質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的硝苯地平，假手術(shù)組和模型組分別腹腔注射等劑量的生理鹽水作為對照。聯(lián)合給藥組腹腔注射氧化苦參堿、硝苯地平，質(zhì)量濃度同前。

1.4 步態(tài)檢測方法 訓(xùn)練方法：參照關(guān)亞蘭等［11］方法，對大鼠進(jìn)行為期3 d，每日3次的訓(xùn)練。將飼養(yǎng)的大鼠置于空鼠盒內(nèi)并置于步態(tài)儀末端的鼠盒托架中，以建立熟悉的環(huán)境。大鼠置于儀器步行臺跑道起始端，并從大鼠后方給予一定吹風(fēng)刺激直至大鼠跑至末端暗盒中，并于其中適應(yīng)30 s，如果該大鼠適應(yīng)暗盒環(huán)境且未從暗盒的出口跳入下方的飼養(yǎng)鼠盒內(nèi)，可人為將動物置于鼠盒中，認(rèn)為完成了一次訓(xùn)練。按照此法對所有大鼠進(jìn)行訓(xùn)練，直至所有的大鼠在無刺激的條件下能夠不停頓地走過完整跑道。檢測方法：訓(xùn)練后利用CatWalk XT步態(tài)分析系統(tǒng)分別采集各組大鼠步態(tài)行為數(shù)據(jù)，各動物分別進(jìn)行3次實時自然步態(tài)行為錄像，合格的錄像須含有7～8個連續(xù)步數(shù)。氧化苦參堿組、硝苯地平組和聯(lián)合給藥組于訓(xùn)練后第7天給藥，45 min后進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，采集指標(biāo)如下：正常步序比、擺動時間、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、足印長度、足印寬度、最大接觸時間的最大強度、站立時間，利用CatWalk XT Version 10.6分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，取各指標(biāo)均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠身體協(xié)調(diào)性相關(guān)指標(biāo)與坐骨神經(jīng)功能指數(shù)比較 見表1，表2。身體協(xié)調(diào)性相關(guān)指標(biāo)正常步序比、擺動時間中，假手術(shù)組與模型組相比，無顯著變化；與模型組相比，氧化苦參堿組、硝苯地平組、聯(lián)合給藥組均未見明顯差異（P>0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)顯著下調(diào)（P＜0.01）；氧化苦參堿、硝苯地平、氧化苦參堿與硝苯地平聯(lián)合給藥分別使SNL大鼠的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)顯著改善（P＜0.01），且各組與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。提示氧化苦參堿及硝苯地平對SNL神經(jīng)功能病理性疼痛大鼠的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)有改善作用。

表1 各組大鼠正常步序比與坐骨神經(jīng)功能指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠正常步序比與坐骨神經(jīng)功能指數(shù)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n 正常步序比 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)假手術(shù)組 10 92.78±12.96 -19.63±5.13模型組 10 87.39±13.06 -69.09±15.19**氧化苦參堿組 10 88.89±19.25 -35.50±4.35△△硝苯地平組 10 76.07±10.88 -45.46±7.24△△聯(lián)合給藥組 10 85.93±15.56 -35.29±5.83△△

表2 各組大鼠擺動時間比較（s，±s）

表2 各組大鼠擺動時間比較（s，±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10氧化苦參堿組 10左后擺動時間 右后擺動時間 左前擺動時間 右前擺動時間0.19±0.12 0.18±0.04 0.17±0.04 0.16±0.05 0.16±0.05 0.16±0.06 0.17±0.11 0.15±0.07 0.15±0.04 0.17±0.09 0.18±0.03 0.17±0.03硝苯地平組 10 0.16±0.04 0.16±0.05 0.17±0.05 0.17±0.07聯(lián)合給藥組 10 0.17±0.05 0.16±0.05 0.17±0.04 0.15±0.03

2.2 大鼠足印壓力的變化 見圖1～圖5。假手術(shù)組大鼠正常狀態(tài)下四足分別接觸跑道時，每足的足印大小及壓力分布均勻（圖1）。而SNL的神經(jīng)病理性疼痛大鼠在行進(jìn)過程中，結(jié)扎側(cè)左后足（LH）足印明顯變小，而結(jié)扎對側(cè)的右前足（RF）足印變亮（圖2），而未結(jié)扎側(cè)右后足（RH）及結(jié)扎側(cè)左前足（LF）的足印壓力未見到明顯變化，說明脊神經(jīng)結(jié)扎使得SNL大鼠的結(jié)扎側(cè)后足即LH足印壓力變小，結(jié)扎對側(cè)前足即RF足印壓力增大，因此推斷該SNL大鼠因單側(cè)脊神經(jīng)結(jié)扎而重心向?qū)?cè)前移；給予氧化苦參堿、硝苯地平及聯(lián)合給藥后的SNL大鼠與模型組相比，行進(jìn)時的LH足印增大，RF足印變小變暗（圖3～圖5），說明氧化苦參堿及硝苯地平使得SNL疼痛引起的足印及壓力變化情況得到改善。實驗結(jié)果提示氧化苦參堿及硝苯地平能夠糾正SNL疼痛造成結(jié)扎側(cè)LH足的壓力變化及整體重心偏移。

圖1 假手術(shù)組大鼠正常狀態(tài)下四足的足印

圖2 模型組大鼠行進(jìn)時足印

圖3 聯(lián)合給藥組大鼠行進(jìn)時足印

圖4 硝苯地平組大鼠行進(jìn)時足印

2.3 大鼠四足足印參數(shù)的改變 如表3～表6。與假手術(shù)組比較，模型組的LH足印長度、足印寬度、最大接觸時間的最大強度、站立時間4項指標(biāo)均顯著下調(diào)，RF足印寬度顯著上調(diào)（P＜0.05）；氧化苦參堿與硝苯地平聯(lián)合給藥使SNL大鼠足印長度指標(biāo)在LH足顯著上調(diào)，RF足顯著下調(diào)（P＜0.05）；氧化苦參堿、硝苯地平、氧化苦參堿與硝苯地平聯(lián)合給藥使SNL大鼠LH足的足印寬度、最大接觸時間的最大強度、站立時間 3項指標(biāo)顯著上調(diào)（P＜0.05）；同時可見氧化苦參堿與硝苯地平對SNL神經(jīng)病理性疼痛大鼠LH足及RF足的足印長度呈現(xiàn)出部分加和作用（P＜0.05）。

圖5 氧化苦參堿組大鼠行進(jìn)時足印

表3 各組大鼠足印長度比較（cm，±s）

表3 各組大鼠足印長度比較（cm，±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10氧化苦參堿組 10 LH足印長度 RH足印長度 LF足印長度 RF足印長度2.12±0.17 2.13±0.21 1.40±0.28 1.28±0.30 1.64±0.16** 2.01±0.16 1.39±0.19 1.46±0.22 1.84±0.30 2.02±0.47 1.36±0.16 1.31±0.15硝苯地平組 10 1.69±0.18 1.83±0.18 1.44±0.33 1.35±0.17聯(lián)合給藥組 10 1.91±0.28△ 2.02±0.10 1.41±0.25 1.27±0.20△

表4 各組大鼠足印寬度比較（cm，±s）

表4 各組大鼠足印寬度比較（cm，±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10氧化苦參堿組 10 LH足印寬度 RH足印寬度 LF足印寬度 RF足印寬度1.61±0.20 1.49±0.27 1.13±0.24 1.04±0.20 1.22±0.18** 1.38±0.28 1.13±0.18 1.20±0.22△1.45±0.13△ 1.43±0.20 1.14±0.13 1.05±0.12硝苯地平組 10 1.43±0.10△ 1.39±0.09 1.07±0.15 1.09±0.22聯(lián)合給藥組 10 1.48±0.26△△ 1.30±0.14 1.14±0.10 1.03±0.16

表5 各組大鼠最大接觸時間的最大強度比較（±s）

表5 各組大鼠最大接觸時間的最大強度比較（±s）

RF最大接觸時間的最大強度103.95±13.73 96.34±18.15 95.44±9.60 90.16±16.97 68.26±18.40** 92.29±20.21 94.50±14.95 93.38±17.03 90.40±15.61△ 87.55±14.43 93.60±14.10 91.57±7.20硝苯地平組 10 92.33±11.72△ 82.43±9.58 86.20±12.56 90.69±7.50聯(lián)合給藥組 10 94.83±14.19△△ 85.30±11.33 96.87±11.20 91.83±11.29組 別 n LH最大接觸時間的最大強度RH最大接觸時間的最大強度LF最大接觸時間的最大強度假手術(shù)組 10模型組 10氧化苦參堿組 10

表6 各組大鼠站立時間比較（s，±s）

表6 各組大鼠站立時間比較（s，±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10氧化苦參堿組 10左后站立時間 左后站立時間 左后站立時間 左后站立時間0.27±0.03 0.24±0.06 0.18±0.06 0.19±0.06 0.01±0.01** 0.20±0.07 0.16±0.04 0.15±0.08 0.18±0.03△△ 0.22±0.03 0.18±0.01 0.20±0.05硝苯地平組 10 0.19±0.02△△ 0.25±0.01 0.18±0.08 0.15±0.08聯(lián)合給藥組 10 0.19±0.01△△ 0.24±0.09 0.19±0.05 0.21±0.07

3 討 論

CatWalk全自動步態(tài)分析儀是一個包含軟件及硬件的完整系統(tǒng)，它使用腳印光亮折射技術(shù)，利用高速攝像機(jī)從步行臺下方捕獲每一個腳步的細(xì)節(jié)，且能探測到四足的壓力差異，從而檢測動物重心的分配情況。并且能對運動失調(diào)、疼痛、神經(jīng)損傷等研究領(lǐng)域進(jìn)行步態(tài)行為評估［12-14］。步態(tài)分析中與神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)的指標(biāo)主要有：坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、最大接觸時間的最大強度、足印長度等，同時，有文獻(xiàn)報道正常步序比、站立時間、擺動時間等參數(shù)可能與大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型相關(guān)［15］。

本實驗利用脊神經(jīng)結(jié)扎的大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型（SNL模型），結(jié)合CatWalk全自動步態(tài)分析儀，采集大鼠足印并進(jìn)行軟件自動定量分析，評價藥物對SNL神經(jīng)病理性疼痛大鼠步態(tài)的影響，比嚙齒類動物疼痛行為學(xué)研究中的面部表情疼痛量表及連續(xù)后足使用評分等方法［16-18］更客觀更精確，是對嚙齒類動物疼痛評估方法［18］的補充。

本實驗利用CatWalk全自動步態(tài)分析儀采集大鼠的自然步態(tài)及足印，并自動定量分析大鼠的多項步態(tài)及足印參數(shù)指標(biāo)，考察SNL神經(jīng)病理性疼痛大鼠在自然行走中的步態(tài)參數(shù)變化。實驗中的大鼠源于同一批次，且各組大鼠均經(jīng)過隨機(jī)挑選產(chǎn)生。經(jīng)實驗結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠的LH足與RH足相比，LF足與RF足相比，各參數(shù)均無顯著性差異，因此我們認(rèn)為其步態(tài)基數(shù)處于同一水平。模型組與假手術(shù)組比較，坐骨神經(jīng)功能指數(shù)顯著降低，與文獻(xiàn)報道的SFI值越負(fù)，坐骨神經(jīng)損傷越嚴(yán)重［19］相一致，說明 L5、L6脊神經(jīng)結(jié)扎的SNL神經(jīng)病理性疼痛模型成功建立，已使SNL大鼠的坐骨神經(jīng)功能發(fā)生障礙，并影響到大鼠正常的步態(tài)行為。

HVDCCs鈣通道阻斷劑能選擇性阻滯細(xì)胞膜鈣離子通道，延遲失活態(tài)鈣通道的恢復(fù)，減少鈣離子內(nèi)流，降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣，阻礙敏感細(xì)胞的鈣依賴性活動而產(chǎn)生相應(yīng)藥理作用［20］。其中L-型鈣通道阻斷劑Nimodipine可對抗糖尿病大鼠痛覺過敏反應(yīng)［21-22］，N-型鈣通道阻斷劑Ziconotide［23］已在美國上市用于神經(jīng)病理性疼痛治療，并有神經(jīng)病理性疼痛一線治療藥物的鈣通道調(diào)節(jié)劑加巴噴丁通過結(jié)合HVDCCs的輔助亞基而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

近年來，本課題組通過系列研究證明［24-25］氧化苦參堿對神經(jīng)病理性疼痛具有抑制作用并且發(fā)現(xiàn)該鎮(zhèn)痛作用機(jī)制與HVDCCs有關(guān)。本實驗中氧化苦參堿及L-型鈣通道阻斷劑硝苯地平均使SNL大鼠的SFI顯著升高，表明氧化苦參堿及L-型鈣通道阻斷劑硝苯地平對神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠步態(tài)有明顯改善作用。氧化苦參堿與硝苯地平聯(lián)合給藥能使SNL大鼠LH的足印長度顯著增長，而氧化苦參堿、硝苯地平單獨給藥則未能呈現(xiàn)顯著變化；氧化苦參堿與硝苯地平聯(lián)合給藥使SNL大鼠LH的足印的足印寬度、最大接觸時間的最大強度等指標(biāo)的改善情況比氧化苦參堿、硝苯地平單獨給藥更顯著，提示硝苯地平可能對氧化苦參堿的鎮(zhèn)痛作用具有增補作用。

此外，模型組與假手術(shù)組比較，LH側(cè)的站立時間減少，正常步序比不變，這與文獻(xiàn)報道的炎性和慢性壓迫損傷（CCI）大鼠疼痛模型的實驗結(jié)果相一致［15，26-27］。

本研究利用CatWalk步態(tài)分析儀，初步考察了氧化苦參堿及L-型鈣通道阻斷劑硝苯地平對神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠步態(tài)行為的改善作用，肯定了氧化苦參堿及硝苯地平對神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用，拓展了神經(jīng)病理性疼痛大鼠的行為評價方法和指標(biāo)，同時也為深入研究氧化苦參堿鎮(zhèn)痛作用的鈣通道相關(guān)機(jī)制提供了可靠依據(jù)。

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