馬鈴薯Y病毒衣殼蛋白的原核表達(dá)及抗血清制備

王玉+黃顯德+魏代福+溫亮+楊舉田+陳秀齋+田延平

摘要：采用RT-PCR方法擴(kuò)增馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）衣殼蛋白（coat protein，CP）基因，將其連接到原核表達(dá)載體pEHISTEV上，獲得重組質(zhì)粒pEHISTEV-PVY-CP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后，可以表達(dá)出分子量為35 kD的融合蛋白。切膠回收融合蛋白，免疫新西蘭大耳兔制備PVY CP抗血清。間接ELISA結(jié)果表明，該抗血清的效價(jià)為1∶16384，Western blot分析表明該抗血清只與感染PVY的普通煙植株有特異性反應(yīng)，而與健康普通煙和感染PVX的普通煙植株無(wú)反應(yīng)。本研究為PVY的血清學(xué)檢測(cè)以及早期預(yù)警奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯Y病毒；衣殼蛋白；原核表達(dá)；抗血清制備

中圖分類號(hào)：S532：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）01-0111-04

Abstract The coat protein （CP） gene of Potato virus Y （PVY） was amplified by RT-PCR and was cloned into prokaryotic expression vector pEHISTEV to produce recombinant plasmid pEHISTEV-PVY-CP， which was transformed into competent cells of Escherichia coli strain Rosetta， and a 35 kD fusion protein was expressed after induced by IPTG. The fusion protein was cut from the gel and used as antigen to immunize rabbits for production of polyclonal antiserum against the PVY CP. The titer of the resultant antiserum was 1∶16384 in ELISA. In Western blot assay， the antiserum showed specific positive reaction only with Nicotiana tabacum plants infected with PVY， but not with healthy Nicotiana tabacum plants or those infected with Potato virus X. The results laid bases for serological test and early warning work of PVY.

Keywords Potato virus Y； Coat protein； Prokaryotic expression； Antiserum preparation

馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是危害馬鈴薯、煙草等茄科植物的主要病毒之一。PVY侵染馬鈴薯可引起葉脈壞死、褐脈、黃斑壞死等癥狀，導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)80%以上[1-3] ，對(duì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失；PVY侵染煙草后可造成煙葉產(chǎn)量損失達(dá)20%～50%，嚴(yán)重時(shí)可造成絕收[4，5]。PVY自1931年首次在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已在全球廣泛傳播[6]。20世紀(jì) 90 年代初， PVY 在中國(guó)及亞洲地區(qū)周邊國(guó)家呈上升發(fā)展趨勢(shì)，目前該病毒在世界各地均有發(fā)生[7-10]。

馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）屬于馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），主要由蚜蟲(chóng)以非持久方式傳播。病毒粒體為彎曲線狀，無(wú)包膜，大小約11 nm×700～900 nm，基因組為長(zhǎng)約10 kb的正單鏈RNA，通過(guò)多聚蛋白策略編碼1個(gè)多聚蛋白，經(jīng)蛋白酶切割后形成10個(gè)蛋白，PVY 基因組內(nèi)還有一個(gè)由移碼翻譯產(chǎn)生的PIPO蛋白，通過(guò)這兩種方式最后形成11個(gè)成熟的多功能蛋白[11-14]。

目前，血清學(xué)方法由于具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度較高等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于病毒病的快速檢測(cè)。本試驗(yàn)，我們選用質(zhì)粒 pEHISTEV構(gòu)建PVY CP的原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中高效表達(dá)，通過(guò)免疫新西蘭大耳兔制備相應(yīng)的特異性抗血清，以期為 PVY檢測(cè)和預(yù)警奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株Escherichia coli DH5α、Rosetta （DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存，原核表達(dá)載體pEHISTEV由英國(guó)安德魯斯大學(xué)劉煥庭老師惠贈(zèng)；反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、無(wú)RNA酶的水等均購(gòu)自TaKaRa公司；植物總RNA提取試劑盒TRIzol、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；硝酸纖維素膜為 PallGelman 公司產(chǎn)品；堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG、弗氏完全佐劑及不完全佐劑購(gòu)自Sigma 公司；Western blot 所用蛋白Marker 購(gòu)自Thermo公司；IPTG、DTT、KCl 等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)PVY-N605（GenBank序列號(hào)：X97895）基因組序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PVY CP基因。正向引物為PVY-CP-NcoⅠ-F：5′-CAT GCC ATG GCT TGG AAT GCA ACA ATC GAT GCA G-3′，下劃線部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn)；反向引物為PVY-CP-BamHⅠ-R：5′-CGC GGA TCC TTA CAT GTT CTT CAC TCC AAG TAG AGT ATG C-3′，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)。以本實(shí)驗(yàn)室采集的感染PVY的普通煙葉片為材料，參照TransZol 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取葉片總RNA。以總RNA 為模板，在隨機(jī)引物的引導(dǎo)下利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈 cDNA。利用引物PVY-CP-NcoⅠ-F和PVY-CP-BamHⅠ-R，以cDNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增CP基因。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性30 s；98℃ 10 s，64.8℃ 20 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。endprint

將目的片段和pEHISTEV分別用NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切，利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆送濟(jì)南博尚公司測(cè)序驗(yàn)證。序列正確的重組質(zhì)粒命名為pEHISTEV-PVY-CP。

1.2.2 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將pEHISTEV-PVY-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，涂布到含50 mg/L卡那霉素的LB平板上。挑取單菌落接種到含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。取1 mL培養(yǎng)液稀釋于100 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.6。IPTG終濃度設(shè)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 5個(gè)處理，于28℃、150 r/min誘導(dǎo)4 h。取誘導(dǎo)菌液1 mL，12 000 r/min離心2 min，加適量TE緩沖液（pH值8.0）振蕩懸浮，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。通過(guò)比較蛋白表達(dá)量，篩選最佳IPTG濃度。誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)1、2、3、4、5 h和6 h共6個(gè)處理，在最佳IPTG濃度下，篩選最適誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.3 抗血清的制備、效價(jià)及特異性的測(cè)定 通過(guò)SDS-PAGE電泳對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離，用冰冷的0.25 mol/L KCl和1 mmol/L DTT染色，切取乳白色目的條帶，加入適量0.9%生理鹽水在滅菌的研缽中研磨。采用皮下多點(diǎn)注射的方法免疫新西蘭大耳兔，初次免疫用等體積的弗氏完全佐劑乳化，之后改用弗氏不完全佐劑。每隔一周免疫一次，免疫劑量為3 mL，共免疫4次。第四次免疫后一周取血，通過(guò)離心分離血清。

取PVY接種的普通煙葉片，按1∶10（W/V）抗原包被緩沖液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值9.6），充分研磨后8 000～10 000 r/min離心2 min，取上清包被酶聯(lián)板，每孔100 μL。以用同樣的方法處理的健康普通煙葉片作為陰性對(duì)照，以0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液為空白對(duì)照?？寡灏凑?∶26～1∶215進(jìn)行梯度稀釋。利用ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)。顯色后使用酶標(biāo)儀讀取405 nm的OD值，I（待測(cè)樣品讀數(shù)-空白讀數(shù)）/ H（陰性樣品讀數(shù)-空白讀數(shù)）≥3為陽(yáng)性反應(yīng)。

以感染PVY的普通煙葉片為檢測(cè)對(duì)象，健康普通煙葉片為陰性對(duì)照，同時(shí)以感染馬鈴薯X病毒（PVX）的普通煙葉片為對(duì)照，參照Towbin等[11]的方法進(jìn)行Western blot，分析抗血清的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVY CP基因的克隆

利用引物PVY-CP-NcoⅠ-F和PVY-CP-BamHⅠ-R通過(guò)PCR擴(kuò)增得到825 bp的CP基因。純化回收后用NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切，克隆到同樣酶切處理的pEHISTEV載體中，獲得重組質(zhì)粒pEHISTEV-PVY-CP。通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序證明其開(kāi)放閱讀框正確。

2.2 PVY CP誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析

將pEHISTEV-PVY-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，菌液經(jīng)不同濃度IPTG和時(shí)間誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，與未誘導(dǎo)菌液相比，包含pEHISTEV-PVY-CP的Rosetta菌液在不同的IPTG濃度及時(shí)間段下均表達(dá)出約35 kD的蛋白條帶（圖1、2），與預(yù)期大小一致，說(shuō)明PVY CP在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)。在IPTG終濃度為0.2～1.0 mmol/L時(shí)，隨著IPTG濃度的增加，PVY CP表達(dá)量無(wú)顯著差異（圖1），我們選擇IPTG終濃度為0.2 mmol/L。在IPTG終濃度為0.2 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為1～6 h情況下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng)，目的蛋白的表達(dá)量增加（圖2），我們將誘導(dǎo)時(shí)間定為6 h。

2.3 抗血清效價(jià)

從SDS-PAGE凝膠中切下目的蛋白條帶，經(jīng)乳化后免疫新西蘭大耳兔，獲得PVY CP 抗血清。以感染PVY的普通煙葉片為材料，以健康普通煙葉片為陰性對(duì)照，利用ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)。結(jié)果表明，當(dāng)病汁液稀釋10倍，抗血清稀釋16 384倍時(shí)仍呈現(xiàn)明顯的陽(yáng)性反應(yīng)，而稀釋32 768倍時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明抗血清的效價(jià)為1∶16384（表1）。

2.4 抗血清特異性檢測(cè)

Western blot結(jié)果顯示，所制備的PVY CP抗血清僅與感染PVY的普通煙樣品發(fā)生特異性反應(yīng)，而與健康普通煙葉片或感染PVX的普通煙樣品均無(wú)反應(yīng)（圖3），說(shuō)明制備的血清有良好的特異性M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PVY侵染的普通煙葉片；2：PVX侵染的普通煙葉片；3：健康的普通煙葉片。

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯Y病毒是危害馬鈴薯和煙草的主要病毒之一。除單獨(dú)侵染外，在自然環(huán)境中PVY還常與煙草蝕紋病毒（TEV）、煙草脈帶花葉病毒（TVBMV）、馬鈴薯X病毒（PVX）等復(fù)合侵染[15-17]。與TMV和PVX相比，PVY在植株內(nèi)的積累水平較低，不易獲得大量提純病毒，且利用常規(guī)方法提取植物病毒時(shí)不能完全排除寄主蛋白，用這樣的病毒制劑制備的血清容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。本研究利用大腸桿菌表達(dá)的PVY CP制備了抗血清，該抗血清效價(jià)為1∶16384，只與PVY有特異性反應(yīng)，與健康植株和PVX無(wú)反應(yīng)，并且與寄主蛋白也無(wú)反應(yīng)，說(shuō)明獲得的抗血清效價(jià)高、特異性好，為PVY的快速檢測(cè)和早期預(yù)警奠定了良好的基礎(chǔ)。

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