265例神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的臨床病理特征及預后分析

宇永軍 ，張詩武 ，李玉瑋 ，許晨 ，張培達 ，張錫朋 △

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine tumors，NETs）是一組起源于肽能神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的異質性腫瘤，這類腫瘤往往具有一定的分泌特性，能夠分泌特異性的肽類激素，如突觸素（Synaptophysin，Syn）、嗜鉻粒蛋白 A（Chromogranin A，CgA）等。神經(jīng)內(nèi)分泌細胞廣泛分布于人體，不僅存在于一些內(nèi)分泌器官或組織中，還散在分布于支氣管和肺、胃腸道、胰腺的外分泌（導管）系統(tǒng)、膽管和肝臟等，即所謂“彌散性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)（diffuse neuroendocrine system，DNES）”。以往認為NETs是一種少見疾病，但近30年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢［1］。并且NETs一旦惡變后死亡率很高［2］，所以越來越引起大家的關注。然而目前國內(nèi)外關于NETs相關的研究報告尚少見，所見文獻報道多以個案報道為主，少見大樣本的臨床報道。本研究回顧性分析了天津市人民醫(yī)院2006年1月—2015年8月收治的265例NETs患者資料，以進一步明確NETs的發(fā)病特征、臨床表現(xiàn)、病理分型、治療及預后情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2006年1月—2015年8月我院有完整病歷資料的265例NETs患者，其中男160例，女105例；年齡15～80歲，平均發(fā)病年齡為（55.8±2.7）歲，發(fā)病高峰為55～65歲。所有病例均通過詳細術前檢查，包括實驗室檢查，如血常規(guī)、腫瘤標志物等，以及影像學檢查如內(nèi)鏡、CT、超聲等輔助檢查，明確病灶部位、大小、形狀及是否有轉移，最終由組織活檢或術后病理及免疫組化明確診斷。追蹤患者病史，無明顯家族史。排除年齡＞80歲或合并其他惡性腫瘤的患者。265例患者中，232例（87.5%）進行了手術治療，28例（10.6%）接受了放化療治療，5例患者因高齡或其他原因未行治療。手術治療中以胃腸道腫瘤為例，（結直腸+胃）以內(nèi)鏡下局部切除為主共129例，行結直腸切除16例，行胃切除9例。28例放化療患者中單純化療9例，單純放療4例，同步放化療15例。化療以鉑類、5-氟尿嘧啶為主。最后依據(jù)病理診斷進行臨床分期發(fā)現(xiàn)：G1期186例（70.2%），G2期54例（20.4%），G3期25例（9.4%）。患者的標本病理特征分析見表1。本研究通過我院倫理委員會審核，所有患者及家屬均于術前簽署手術知情同意書。

Tab.1 Analysis of clinical and pathological features of patients表1 患者的臨床病理特征分析

1.2 病理診斷標準 所有標本經(jīng)4%甲醛溶液（天津久圣有限公司）固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、免疫組化染色。（1）HE染色。組織切片置于HP-D型烘片機（天津久圣有限公司）65℃烘烤2 h；兩步二甲苯脫蠟各10 min，梯度乙醇水化，自來水沖洗；蘇木素（BA-4097，珠海貝索生物技術有限公司）染色1～2 min，伊紅（BA-4098，珠海貝索生物技術有限公司）染色30～60 s；梯度乙醇脫水，二甲苯透明（兩步二甲苯各1 min），中性樹膠封片。（2）免疫組化染色。組織切片經(jīng)常規(guī)烤片，脫蠟至水（同上HE染色）。（3）0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0，ZLI-9065，北京中杉金橋生物技術有限公司）高壓修復（Syn和CgA修復方式）或者EDTA修復液（pH 9.0，ZLI-9069，北京中杉金橋生物技術有限公司）高壓修復（細胞增殖核抗原Ki-67修復方式），0.01 mol/L PBS液（pH 7.4）沖洗3次，每次5 min；3%過氧化氫避光孵育10 min，PBS沖洗；滴加相應的一抗約100μL，置于4℃冰箱孵育過夜（12～16 h），一抗包括兔單克隆抗體Synaptophysin（即用型，SP11，福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）、兔單克隆抗體Chromogranin A（即用型，SP12，福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）和單克隆抗體鼠Ki-67（即用型，MX006，福州邁新生物技術開發(fā)有限公司），PBS清洗；滴加約100μL辣根過氧化物酶標記的二抗（PV-6000，北京中杉金橋生物技術有限公司），37℃孵育 30 min，PBS沖洗；即用型 3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB，ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術有限公司）顯色劑室溫下顯色1～3 min，蘇木素復染1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組化染色過程中均設陽性及陰性對照：利用已知的陽性標本作為陽性實驗對照；將一抗換作PBS用以陰性實驗對照。每張切片隨機選取10個不重復、背景清晰、染色明確的部位進行圖像分析，計數(shù)陽性細胞數(shù)及所有細胞數(shù)。陽性細胞率=陽性細胞數(shù)/所有細胞數(shù)×100%。腫瘤區(qū)域Syn或CgA陽性表達判斷標準：細胞率＞30%定義為陽性（+）。細胞核增殖核抗原（Ki-67）為細胞核陽性表達，Ki-67陽性表達判斷標準：陰性（－）為無陽性細胞或陽性細胞率＜20%，+為細胞陽性率20%～＜50%，++為細胞陽性率50%～80%，+++為細胞陽性率＞80%以上。通過分析Ki-67陽性指數(shù)對NETs進行分級（Ki-67陽性指數(shù)≤2%定義為低級別G1級，Ki-67陽性指數(shù)為3%～20%定義為中級別G2級，Ki-67陽性指數(shù)＞20%定義為高級別G3級）。病理診斷標準依據(jù)2000年WHO關于NETs的分類和2010年WHO關于消化系統(tǒng)腫瘤的藍皮書中有關胃腸、胰腺NETs的分類。術后標本切片均由同一病理科醫(yī)師觀察評定，并對所有病例進行免疫組化分析。

1.3 隨訪 265例患者中198例完成隨訪，分別于術后3個月、6個月、1年、3年、5年多次隨訪。隨訪采用門診復查，電話或短信隨訪相結合的方式。主要隨訪內(nèi)容為內(nèi)鏡檢查、CT、超聲等影像學檢查。隨訪時間為2006年4月—2015年8月，隨訪時長6～60個月，中位隨訪時長為38個月。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用Kaplan-Meier法進行生存分析，生存率的比較采用Log rankχ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 初診的臨床表現(xiàn) 發(fā)病部位不同的患者初次就診的臨床表現(xiàn)各不相同。結直腸患者主要是因排便習慣改變，如腹瀉、便秘、便血等。肺原發(fā)患者多表現(xiàn)為咳嗽或痰中帶血。胃、闌尾或小腸原發(fā)患者多表現(xiàn)為腹痛、腹脹等不適。乳腺原發(fā)患者多表現(xiàn)為乳房脹痛等。大多患者是在檢查中偶然發(fā)現(xiàn)的占位性腫物或微小結節(jié)，影像學表現(xiàn)以消化道發(fā)病患者為例，一般表現(xiàn)為內(nèi)鏡下基底較寬，邊界清楚，呈半球狀的腫物。胸部和腹部其他臟器一般是術前MRI或CT發(fā)現(xiàn)，見圖1。本研究265例患者中，252例（95.1%）患者無類癌綜合征表現(xiàn)，僅有13例（4.9%）伴有潮熱等類癌綜合征的表現(xiàn)。

Fig.1 Radiological and endoscopic features of neuroendocrine tumors圖1 NETs的影像學及內(nèi)鏡下特征

2.2 發(fā)病部位 265例NETs患者中發(fā)病部位主要位于結直腸127例（47.9%），肺部59例（22.3%），胃21例（7.8%），闌尾15例（5.7%），小腸（特別是十二指腸壺腹部及胰腺）10例（3.8%），乳腺 11例（4.2%），頸部10例（3.8%），其他部位12例（4.5%）。結直腸中直腸發(fā)病116例，占結直腸總發(fā)病比例的91.3%；剩余的乙狀結腸為7例，占5.5%；降結腸近脾曲1例，升結腸1例。在肺部發(fā)病患者中，原發(fā)于支氣管27例，占肺部發(fā)病比例的45.8%。在胃的發(fā)病部位中，賁門、胃竇、胃體均有發(fā)病。另有12例患者分別于前列腺、鼓膜、小腦、大腿皮膚組織、腮腺等少見部位發(fā)病。

2.3 病理診斷和臨床分期 265例中病理診斷G1期186例（70.2%），G2期54例（20.4%），G3期（神經(jīng)內(nèi)分泌癌）25例（9.4%），見圖2～4。免疫組化結果顯示，Syn陽性228例（86.4%），CgA陽性102例（38.5%），CD56陽性74例（27.9%）。臨床分期Ⅰ期96例（36.2%），Ⅱ期53例（20.0%），Ⅲ期58例（21.9%），Ⅳ期45例（17.0%），13例（4.9%）分期無法明確。

Fig.2 The hematoxylin and eosin staining(HE)and immunohistochemical staining of Synaptophysin(Syn)in the stage of G1 of NETs圖2 G1期NETs的HE及Syn免疫組化染色

Fig.3 IThe hematoxylin and eosin staining(HE)and immunohistochemical staining of Synaptophysin(Syn)in the stage of G2 of NETs圖3 G2期NETs的HE及Syn免疫組化染色

2.4 治療及隨訪結果 獲得隨訪的198例患者中根據(jù)病理及免疫組化分期，神經(jīng)內(nèi)分泌瘤（G1+G2）178例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌（G3）20例，G1期隨訪患者中無腫瘤相關性死亡；G2期有6例腫瘤相關性死亡；G3期中有19例腫瘤相關性死亡。所有腫瘤相關性死亡的患者中23例發(fā)生了轉移，涉及肝轉移者14例（60.9%）。本組患者的1年、3年、5年生存率分別為94.4%、88.2%、78.5%。神經(jīng)內(nèi)分泌瘤中位生存時間為46.07個月，神經(jīng)內(nèi)分泌癌的中位生存時間為22.95個月。神經(jīng)內(nèi)分泌瘤的生存率明顯高于神經(jīng)內(nèi)分泌癌（Log rankχ2=13.774，P＜0.01），見圖 5。

Fig.4 The hematoxylin and eosin staining(HE)and immunohistochemical staining of Synaptophysin(Syn)in neuroendocrine carcinoma圖4 神經(jīng)內(nèi)分泌癌HE及Syn免疫組化染色

Fig.5 Survival curves of patients with neuroendocrine tumors圖5 NETs患者的生存曲線

3 討論

近年來，臨床文獻報道顯示NETs的發(fā)病率較以往有了很大的增長，美國最近的流行病學調查顯示，在過去30年間NETs的發(fā)病率增加了5倍［1］，因而越來越引起大家的關注和重視。

歐美國家文獻報道，NETs多發(fā)生于消化道，這與天津市人民醫(yī)院收集的這組數(shù)據(jù)顯示消化道共占173例（67.6%）相符，其中直腸又是消化道高發(fā)部位，約占消化道的67.1%（116/173），這一比例要高于以往文獻報道［3］，可能與我院是腸道?？漆t(yī)院，這類患者所占比重偏多有一定關系。本文數(shù)據(jù)顯示肺部的發(fā)病率位居次席，且肺部的原發(fā)灶支氣管部高發(fā)，這與患者多表現(xiàn)為咳嗽為首要癥狀相符，這與國外文獻報道基本一致［4-6］。NETs在胃部的發(fā)病率也較高，魏建明等［7］研究發(fā)現(xiàn)，胃NETs在賁門、胃竇、胃體均有發(fā)病，但是賁門相對高發(fā)，且男性患者預后較女性要差。要文青等［8］研究發(fā)現(xiàn)胰腺NETs的預后明顯優(yōu)于其他胰腺腫瘤，但是因為胰腺部位特殊，容易被誤診。本組數(shù)據(jù)中還發(fā)現(xiàn)在前列腺、鼓膜、腮腺、皮膚組織等部位也出現(xiàn)了NETs的發(fā)病，這進一步證實了NETs是廣泛發(fā)病于全身各個組織和器官的一類腫瘤。

NETs一般可以分為功能性的和非功能性的，在臨床診斷中與其他腫瘤有一定區(qū)別，其生化、腫瘤標志物等指標沒有特異性，影像學也無法很好地與其他腫瘤相鑒別，目前的診斷主要依靠病理和免疫組化。其中Syn、CgA、CD56等指標對于確診這類疾病有重要的意義。2006年歐洲神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤協(xié)會和2010年WHO分別對NETs進行了命名、分級、分期。在本組265例患者中，免疫組化檢查顯示Syn陽性 228例（86.4%），CgA 陽性 102例（38.5%），CD56陽性74例（27.9%）。而根據(jù)Ki-67陽性所占百分比［9］來對NETs進行分期，在265例患者中G1期 186例（70.2%），G2期 54例（20.4%），G3期25例（9.4%）。這一數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)差距較大［1］。回顧性分析考慮這與天津市人民醫(yī)院開展大腸癌篩查有一定關系，大規(guī)模的結腸鏡和胃鏡檢查，對于提高早期（G1期）的檢出率有一定的關系。這也間接證明早期預防性的內(nèi)鏡檢查對于一些發(fā)生在消化道的腫瘤的早期診斷是十分有益的。

對于NETs的治療，目前手術是公認的最主要治療方法［10］，特別是對于早期（G1+G2期）的患者，及時有效的外科手術干預能夠獲得滿意的預后和生存率。本組數(shù)據(jù)中消化道原發(fā)的患者很大一部分通過內(nèi)鏡局部切除即達到了滿意的治療效果，隨訪發(fā)現(xiàn)G1期甚至可以達到臨床根治的效果［11］。然而因為NETs是一種可發(fā)生于身體各個部位的腫瘤，并且臨床表現(xiàn)缺乏特異性，所以有些部位的腫瘤無法在早期發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時大多已經(jīng)發(fā)生轉移。本組數(shù)據(jù)中25例患者確診時已經(jīng)是中晚期（G3期），對于這部分患者，治療方法仍以手術治療為主，但也有采用化療、放療等綜合治療的方法。對于這類患者尚無統(tǒng)一的放化療方案，有采用奧沙利鉑、順鉑、5-氟尿嘧啶、紫杉醇等不同方案的報道。在西方國家則多采用鏈脲霉素聯(lián)合氟尿嘧啶或蒽環(huán)類藥物（如阿霉素）進行化療［11-12］。而我國尚無鏈脲霉素類似藥物的臨床應用。研究顯示，化療對于低分化患者的效果要優(yōu)于高分化患者，特別是對于消化道部位為原發(fā)灶的G3期患者［13］。目前對于晚期無手術機會的NEC患者也沒有標準的化療方案，每個醫(yī)學中心采用的化療方案不盡相同，故仍需要大量的循證醫(yī)學和臨床試驗尋找最佳的化療方案。近年來隨著分子生物技術的飛速發(fā)展，靶向治療和生物治療成為研究熱點。靶向治療主要機制是抑制血管生成和生長因子的產(chǎn)生［14］。目前依維莫司和舒尼替尼已被批準應用于胰腺晚期神經(jīng)內(nèi)分泌癌的治療［15］。生物治療該類疾病的作用機制尚不明確，可能對細胞的增生和抑制腫瘤細胞血管生成方面有一定作用，但具體機制有待于進一步研究。

文獻報道，NETs的預后與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小等多因素有關［16-17］。本組數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，患者的生存率與腫瘤的分級關系最為密切，G1期和G2期患者的生存率明顯高于G3期患者。Pape等［18］的研究顯示，Ki-67 指數(shù)＜2%與≥2%NETs患者的生存情況存在顯著差異，提示Ki-67與NET患者的預后有關。而病理分級正是根據(jù)Ki-67指數(shù)來劃分的。由此可見，生存率與腫瘤的分級關系較為密切。

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