草魚（Ctenopharyngodon idellus）FGF21基因克隆及其表達分析

黃龍 吳本麗 何吉祥 宋光同 陳靜 汪翔 武松

（安徽省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所，合肥 230031）

成纖維細胞生長因子家族（Fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）是一類小型分泌信號蛋白［1］，廣泛參與眾多重要的生物學進程，其中包括生長、發(fā)育、性別決定與分化、細胞分化、增殖、遷移與凋亡等［2-7］。FGFs基因家族的主要特征為與肝素具有較高親和性，并與細胞表面肝素硫酸蛋白聚酶相互作用［8］。FGF21作為FGFs基因家族較晚發(fā)現(xiàn)的成員，是2000年Nishimura等［9］利用同源PCR技術(shù)從小鼠胚胎中分離提取出。FGF21同家族基因相比，它不與肝素相結(jié)合，并無促細胞分裂作用［10］，而是調(diào)控葡萄糖和脂質(zhì)體內(nèi)平衡的重要有益調(diào)節(jié)因子［11-13］。Santoso等［14］研究發(fā)現(xiàn)小鼠腦室內(nèi)注射FGF21后可顯著抑制高血糖小鼠的食物攝入，并激活下丘腦室旁核神經(jīng)元，作為肝-下丘腦網(wǎng)絡(luò)的血糖監(jiān)測信使調(diào)節(jié)能量和葡萄糖代謝。Yang等［15］研究喂食低脂肪、高脂肪和補充魚油高脂肪飲食小鼠過程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21基因參與魚油介導的肝臟脂質(zhì)調(diào)節(jié)和高脂肪飲食喂養(yǎng)小鼠的抗炎作用。

克隆FGF21基因cDNA序列并揭示其在各組織中的表達情況，是進行該基因表達研究的基礎(chǔ)。近年來，在斑馬魚［16］、雙色雀鯛、青鳉［17］、虹鱒等魚類中陸續(xù)完成了FGF21基因注釋，并對亞洲鱸魚FGF21基因進行了分子特征和定位研究［18］。而對傳統(tǒng)養(yǎng)殖魚類FGF21基因的研究報道較少。本研究以草魚（Ctenopharyngodon idellus）為實驗動物，采用RT-PCR技術(shù)克隆出草魚FGF21基因cDNA序列，并運用生物信息學方法分析其氨基酸序列與其他物種的同源性，構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹，并檢測草魚幼魚不同組織中FGF21基因表達情況，將為今后進一步研究草魚FGF21基因在關(guān)鍵組織中的作用機制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料取自安徽省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所試驗基地。草魚幼魚在200 L養(yǎng)殖缸中進行飼養(yǎng)，其中水溫20℃。挑選個體濕重59.96±1.08 g草魚3尾進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 草魚FGF21基因全長cDNA克隆 根據(jù)GenBank中登錄的斑馬魚（NP_001038789.1）FGF21基因序列設(shè)計PCR擴增引物P1和P2，根據(jù)鯉（XP_018926023.1）FGF21基因序列設(shè)計PCR擴增引物P3，均用于克隆草魚FGF21基因保守區(qū)；引物P4用于克隆草魚FGF21 mRNA全長；P5為定量表達的基因特異性引物，P6為定量表達的內(nèi)參引物，以上引物均采用Primer Premier 5.0 設(shè)計，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（表1）。草魚活體解剖，快速分離出肝臟組織，液氮研磨至粉末狀，使用 RNeasy Lipid Tissue Mini Kit（QIAGEN，Germany）試劑盒，按推薦方法提取肝臟總RNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，GeneQuant核酸定量儀（Biochrom，England）檢測RNA的濃度后-80℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增FGF21基因序列，25 μL反應(yīng)體系含 ：PCR Master Mix（TaKaRa，China）12.5 μL， 模板cDNA 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增條件為：94℃變性40 s、52℃退火40 s、72℃延伸60 s，共35個循環(huán)；反應(yīng)前 95℃ 預變性5 min；反應(yīng)后72℃充分延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，克隆測序。

表1 試驗所用引物序列及預期產(chǎn)物大小

1.2.2 草魚FGF21基因生物信息學分析 利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST在線工具進行同源性比對；用EditSeq對序列進行編輯和分析，尋找開放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列；利用MEGA 7.0采用鄰接（Neighbor joining，NJ）法構(gòu)建基于FGF21氨基酸序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹；利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析推導蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；利用PSORT II Prediction（https://psort.hgc.jp/form2.html）進行亞細胞定位；利用 TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 預 測 信 號肽序列；利用NetPhos 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/）、NetOGlyc 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）、NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）分析預測FGF21蛋白磷酸化位點、O糖基化位點、N糖基化位點；采用PRABI預測蛋白二級結(jié)構(gòu)（http://www.prabi.fr）；采用STRING（https://string-db.org）交互式數(shù)據(jù)庫搜索可能的相互蛋白。

1.2.3 草魚FGF21基因?qū)崟r熒光定量PCR 采用SYBR Green實時熒光定量PCR方法，對FGF21基因表達進行定量研究。從GenBank中獲得內(nèi)參基因β-actin，登錄號為NC_007112.6，內(nèi)參基因引物見表1。實時熒光定量PCR反應(yīng)在CFX96 TouchTM（BIO-RAD，USA）PCR儀上進行。采用QuantiFast SYBR Green PCR Kit（QIAGEN，Germany）定量試劑盒，20 μL的反應(yīng)體系中包含2×PCR Master Mix 10.0 μL，10 μmol /L 的上、下游引物各 1.0 μL 和模板 cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。采用 2 步 PCR 法進行擴增，首先95℃預變性5 min，然后是40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性10 s和60℃延伸30 s，循環(huán)結(jié)束后，從60℃緩慢升溫到95℃，制備熔解曲線。每次反應(yīng)都設(shè)置無模板對照，每個樣品設(shè)3個技術(shù)重復。草魚活體解剖，快速分離肝臟、腸道、心臟、肌肉、腎臟和全腦等組織，采用QuantiTect Reverse Transcription Kit（QIAGEN，Germany）反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別提取總RNA，以Primer Mix為引物，按試劑盒推薦方法去除DNA污染并反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第1鏈，稀釋10倍用于熒光定量分析。

1.2.4 基因定量數(shù)據(jù)分析 使用2-ΔΔCt法對定量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。目的基因的相對表達量為2-ΔΔCt，ΔΔCt表示內(nèi)參基因，其中以 β-Actin為內(nèi)參基因，以對照組目標基因與內(nèi)參基因的Ct差值平均值做為參照值，x表示任意一樣本，其公式如下：

上述公式計算了每一個樣本目標基因的表達量，通過內(nèi)參基因校正后，數(shù)據(jù)用“平均值±標準差（Mean±SD）”表示。采用GraphPad Prism 6軟件對實驗數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計學分析和作圖，均值差異顯著性用t-test方法進行分析比較。

2 結(jié)果

2.1 草魚FGF21基因全長cDNA結(jié)構(gòu)

采用RT-PCR技術(shù)獲得草魚FGF21基因擴增序列，通過比對分析擴增序列得到該基因保守區(qū)片段，進而獲得其cDNA全長（GenBank登錄號為MF_094727），共 615 bp，其中5'端非翻譯區(qū)51 bp，開放閱讀框564 bp，編碼187個氨基酸，A+T含量53.9%，G+C含量46.1%（圖1）。

2.2 草魚FGF21蛋白結(jié)構(gòu)分析

采用ProParam在線軟件對草魚FGF21基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果顯示其編碼的蛋白質(zhì)由187個氨基酸組成，分子質(zhì)量為21.25 kD，理論等電點pI為5.86，酸性氨基酸占12.83%，堿性氨基酸占10.70%，極性氨基酸占31.02%，疏水性氨基酸占27.81%，為不穩(wěn)定親水性蛋白。該蛋白具有10個絲氨酸磷酸化位點、2個蘇氨酸磷酸化位點和3個絡(luò)氨酸磷酸化位點，在第139個氨基酸殘基有一個O-糖基化位點，無N-糖基化位點。該蛋白不具有信號肽結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域。亞細胞定位發(fā)現(xiàn)其主要在細胞核（65.2%）發(fā)揮生物學功能，部分在線粒體（30.4%）和細胞骨架（4.3%）中發(fā)揮生物學功能。草魚FGF21蛋白二級結(jié)構(gòu)預測顯示，38（20.32%）個氨基酸可能形成α-螺旋（h），40（21.39%）個氨基酸可能形成β-折疊（e），109（58.29%）個氨基酸可能形成無規(guī)則卷曲（c）。采用STRING交互式數(shù)據(jù)庫搜索FGF21蛋白的可能相互作用蛋白，結(jié)果顯示該蛋白可能和FGFR1A、FGFR4、FGF2、INSB和INS等蛋白存在相互作用（圖2）。

圖1 草魚FGF21基因核苷酸及推測的氨基酸序列

圖2 與草魚FGF21蛋白相互作用蛋白預測

2.3 同源性比較

Blast發(fā)現(xiàn)，草魚FGF21基因氨基酸序列與其他物種的同源性較高，其中，與斑馬魚（Danio rerio，NP_001038789.1）FGF21基因的氨基酸序列同源性最高，為78.86%；與犀角金線鲃（Sinocyclocheilus rhinocerous，XP_016399769.1）、鯉（Cyprinus carpio，XP_018926023.1）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss，CDQ66092.1）、大西洋鮭（Salmo salar，XP_01401467 0.1）、羅非魚（Oreochromis niloticus，XM_00343846 8.3）和日本青鱂（Oryzias latipes，NC_019877.1）的同源性分別為77.66%、73.94%、53.29%、52.41%、43.71%和35.96%；與小鼠（Mus musculus，NC_00 0073.6）和人（Homo sapiens，NC_000019.10）的同源性最低，分別為30.39%和31.87%，氨基酸序列比較結(jié)果見圖3。

根據(jù)以上物種FGF21基因氨基酸序列運用MEGA 7.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹（圖4），可以看出，草魚與鯉、犀角金線鲃和斑馬魚聚為一支，親緣關(guān)系最近，與人和小鼠的親緣關(guān)系最遠，與其他魚類的親緣關(guān)系介于兩者之間。

2.4 草魚FGF21基因的組織表達分析

以β-actin為內(nèi)參基因，采用qPCR方法對草魚FGF21 mRNA在肝臟、前腸、中腸、后腸、心臟、肌肉、腎臟和全腦等組織中的表達進行了研究。結(jié)果（圖5）表明，所有組織中均檢測到FGF21 mRNA的表達，肌肉的相對表達量極顯著高于其他組織（P＜0.01），中腸和前腸組織次之，極顯著高于后腸、心臟、肝臟、腎臟和全腦（P＜0.01）。

3 討論

FGF21作為肝合成的一種多肽，其在調(diào)控脂肪分解與合成［19-20］，促進葡萄糖轉(zhuǎn)運［10，21］，增加肝臟酮生產(chǎn)［22-23］，胰島素抵抗［24-25］等生命活動發(fā)揮重要作用。本研究首先克隆獲得草魚FGF21基因全長序列615 bp，包括完整的ORF區(qū)564 bp，編碼187個氨基酸，與NCBI上登錄的斑馬魚、犀角金線鲃和鯉FGF21氨基酸序列同源性分別為78.86%、77.66%和73.94%，表明FGF21氨基酸序列在上述物種中具有較高保守性。草魚FGF21蛋白不具有信號肽結(jié)構(gòu)，對斑馬魚、鯉、犀角金線鲃和大西洋鮭等物種FGF21蛋白信號肽進行預測，均不具有信號肽結(jié)構(gòu)，說明魚類FGF21蛋白信號肽結(jié)構(gòu)具有相似性，但與李倩等［26］在山羊中的研究結(jié)果不同，說明魚類與哺乳類動物FGF21蛋白信號肽結(jié)構(gòu)差別較大。亞細胞定位結(jié)果顯示FGF21基因主要在細胞核發(fā)揮生物學功能，這與其不具有信號肽的預測結(jié)果相一致。

圖 3 草魚與其他物種FGF21氨基酸序列比較

為了確定草魚FGF21基因的組織表達特性，本研究采用qPCR技術(shù)檢測了FGF21基因在草魚幼魚時期各組織中的表達情況，結(jié)果顯示FGF21基因主要在肌肉中高水平表達，其次是前腸、中腸、后腸和心臟組織，而在腎臟和全腦中低水平表達。這與前人研究結(jié)果存在相似和不同之處，Izumiya等［27］研究發(fā)現(xiàn)FGF21蛋白在禁食小鼠骨骼肌和肝臟中大量表達。Wang等［18］在研究亞洲鱸魚FGF21基因組織表達特性的時候發(fā)現(xiàn)，該基因在腎臟、小腸組織中表達，而肝臟、脾臟、心臟、脂肪和肌肉等組織中未檢測到表達。Thomou等［28］研究發(fā)現(xiàn)FGF21基因在小鼠肝臟、脂肪、胰腺中高水平表達，而在腎臟和肌肉中低水平表達。綜合以上研究結(jié)果表明FGF21基因的組織表達具有物種特異性。

FGF21基因在草魚肌肉和腸道組織中的高表達提示其可能在草魚上述組織中具有重要調(diào)控作用。而Izumiya等［27］指出小鼠骨骼肌FGF21基因表達受到PI3 /Akt1 信號通路調(diào)控。Wang等［18］指出FGF21基因在亞洲鱸魚腸道等組織特異性表達可能與禁食和急性期反應(yīng)應(yīng)答相關(guān)。這些研究結(jié)果提示，F(xiàn)GF21基因在草魚肌肉和腸道組織可能會行使相似的生物學功能，但FGF21基因如何在草魚各組織器官中發(fā)揮功能，仍需要進一步的試驗解析。

圖 4 FGF21基因氨基酸序列的NJ系統(tǒng)樹

圖 5 草魚FGF21基因在不同組織中的表達水平

4 結(jié)論

本研究克隆獲得草魚FGF21基因全長序列615 bp（GenBank登錄號為MF_094727），包括完整的ORF區(qū)564 bp，編碼187個氨基酸。FGF21基因在草魚肝臟、前腸、中腸、后腸、心臟、肌肉、腎臟和全腦等組織中存在廣泛表達，且在肌肉、前腸和中腸組織中存在較高水平表達，推測該基因可能在草魚肌肉和腸道等組織中發(fā)揮重要生物學功能。

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