小分子化合物誘導(dǎo)細胞重編程研究進展

顧珊 趙高平 李喜和，

（1. 內(nèi)蒙古大學(xué)蒙古高原動物遺傳資源研究中心，呼和浩特 010021；2. 內(nèi)蒙古賽科星家畜種業(yè)與繁育生物技術(shù)研究院有限公司，呼和浩特 011517）

細胞重編程指細胞內(nèi)的基因表達由一種類型轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型，通常包含兩層含義：一是分化的細胞重新恢復(fù)到多能性或全能性狀態(tài)；二是從一種分化的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N分化的細胞。細胞重編程可為臨床患者特異性細胞治療提供無限的細胞資源，研究人員可以通過細胞核移植、轉(zhuǎn)染特定轉(zhuǎn)錄因子、小分子化合物誘導(dǎo)等途徑進行細胞重編程。細胞核移植技術(shù)可以將供體細胞核重新編程，進入類似受精卵發(fā)育的過程，發(fā)育到囊胚甚至產(chǎn)生完整個體，因此，細胞核移植技術(shù)成為早期研究中獲得用于疾病治療干細胞的可能途徑，但因細胞核移植技術(shù)通常需要使用卵子，而存在倫理問題的爭議導(dǎo)致其研究進一步受阻。自2006年山中伸彌等［1］首次利用轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的方法從體細胞獲得誘導(dǎo)多能干 細 胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs） 以來，重編程技術(shù)被廣泛研究，并試圖用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在重編程技術(shù)的引領(lǐng)下，細胞轉(zhuǎn)分化研究興起。但早前研究的細胞重編程和轉(zhuǎn)分化均涉及逆轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)，從而增加了基因突變的風(fēng)險。近些年，研究者們開始探索更安全的細胞類型轉(zhuǎn)換方式，但轉(zhuǎn)換效率極低［2-5］。另外，更多的研究者試圖使用小分子化合物誘導(dǎo)細胞類型轉(zhuǎn)換。小分子化合物具有可替代重編程因子的重編程作用。如在誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞（Neural stem cells，NSCs）到iPSCs過程中，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a抑制劑BIX01294可替代 Oct4（O）［6］，Kenpaullone可以替代 Klf4（K）［7］。另外，在iPSCs產(chǎn)生過程中，轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）抑制劑 616452可以替代Sox2（S）［8-10］。因小分子化合物具有易滲透到細胞中，非免疫原性，成本效益低，更容易控制濃度和作用時間等諸多優(yōu)勢，其誘導(dǎo)細胞重編程技術(shù)成為近年來細胞重編程領(lǐng)域新的研究方向。文中對小分子化合物誘導(dǎo)的幾種不同細胞重編程類型做了綜述，旨在為今后這方面的研究提供借鑒。

1 小分子化合物誘導(dǎo)多能干細胞

近些年研究發(fā)現(xiàn)小分子化合物可以提高重編程效率［11-15］，一些小分子化合物甚至可以替代逆轉(zhuǎn)錄因子。研究者試圖進一步用小分子化合物替換外源轉(zhuǎn)錄因子，最終實現(xiàn)完全的化學(xué)重編程。Li等［16］使用Oct4/Sox2/Klf4三個慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染Oct4啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白（Oct4 promoterdriven green fluorescent protein，OG）標記的鼠成纖維細胞（Mouse embryonicfibroblasts，MEFs），同時采用小分子化合物丙戊酸（Valproic acid，VPA）與CHIR99021（CHIR）處理細胞，發(fā)現(xiàn)重編程效率顯著提高。隨后使用Oct4和Klf4轉(zhuǎn)染OG-MEFs，同時在VPA和CHIR基礎(chǔ)上，添加TGF-β抑制劑616452組成VC6共同處理細胞發(fā)現(xiàn)，15 d 后獲得GFP陽性的iPSCs，而僅使用單基因Oct4轉(zhuǎn)染與VC6組合進行重編程的效率極低。進一步研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H3第4位賴氨酸去甲基化酶抑制劑反苯環(huán)丙胺（Tranylcypromine）可顯著提高重編程效率，與VC6組合（VC6T）處理僅轉(zhuǎn)染Oct4的OG-MEFs，18 d 后獲得GFP陽性iPSCs，該效率相比Oct4與VC6組合顯著提高。單基因Oct4與VC6T組合獲得的iPSCs（Oct4-iPSCs）具有正常的核型和堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）活性，形態(tài)學(xué)上類似典型的iPSCs，將Oct4-iPSCs注入免疫缺陷小鼠皮下組織，4周后可形成具有三胚層的畸胎瘤，將Oct4-iPSCs注入8細胞囊胚并移植于代孕母鼠子宮中可生產(chǎn)嵌合鼠。這些結(jié)果表明，Oct4-iPSCs具有類似于胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESCs）的特性。

研究發(fā)現(xiàn)福斯科林（Forskolin，F(xiàn)SK），2-甲基-5-羥基色胺和D4476等小分子化合物在沒有Oct4基因表達的情況下，結(jié)合Sox2、Klf4和c-Myc（M）3個逆轉(zhuǎn)錄因子，可使OG-MEFs重編程為iPSCs，因此可作為Oct4的化學(xué)“替代物”。隨后使用VC6T與3種Oct4化學(xué)替代物共同處理OG-MEFs，發(fā)現(xiàn)VC6T與FSK組合（VC6TF）處理細胞16 d后得到GFP陽性克隆，這些GFP陽性克隆表達E-鈣黏蛋白，間質(zhì)向上皮細胞轉(zhuǎn)化標記，類似于逆轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的早期重編程。但這些GFP陽性克隆Oct4和Nanog的啟動子區(qū)維持超甲基化狀態(tài)，表明Oct4和Nanog在表觀遺傳上仍處于抑制狀態(tài)［17］。為了實現(xiàn)完全化學(xué)重編程，Hou等［17］進一步篩選其他小分子化合物時發(fā)現(xiàn)，VC6TF處理細胞16 d 后加入DZNep（VC6TFZ），可獲得更多GFP陽性克隆，這些陽性克隆形態(tài)緊湊，具有上皮樣特征，無明顯邊界，大多數(shù)多能性標記基因的表達水平升高但仍低于ESCs表達水平，表明GFP陽性克隆仍處于不完全重編程狀態(tài)。將這些GFP陽性克隆經(jīng)VC6TFZ處理28 d后轉(zhuǎn)到糖原合酶激酶-3（Glycogen synthase kinase，GSK3）和絲裂原活化蛋白雙重抑制（Dual inhibition，2i）培養(yǎng)基后，GFP陽性克隆逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镋SCs樣形態(tài)。這些ESCs樣克隆可擴增培養(yǎng)30多代并維持ESCs樣形態(tài)。最后研究者將這些適應(yīng) 2i 培養(yǎng)體系，ESCs樣，GFP陽性克隆定義為化學(xué)誘導(dǎo)多能干細胞（Chemically induced pluripotent stem cells，CiPSCs）。 隨 后 篩 選其他小分子化合物發(fā)現(xiàn)，合成物視黃酸受體配體TTNPB可提高化學(xué)重編程效率達到40 倍，達到逆轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的重編程效率（0.2%）。進一步分析建系的CiPSC發(fā)現(xiàn)，其倍增時間（14.1 h-15.1 h）類似于ESCs（14.7 h），具有AP活性并表達多能性標記，其基因表達譜與ESCs和OSKM-iPSCs相似。CiPSCs中的Oct4和Nanog啟動子的DNA甲基化狀態(tài)和組蛋白修飾類似于ESCs。此外，CiPSCs在13代以內(nèi)具有正常核型和基因組完整性。將CiPSCs注射到免疫缺陷老鼠皮下能形成分化出三胚層的畸胎瘤。將CiPSCs注射到8細胞胚胎或囊胚中能產(chǎn)生嵌合鼠。相比OSKM-iPSCs產(chǎn)生的嵌合體，由CiPSCs產(chǎn)生的嵌合小鼠更健康，存活長達6個月。這些結(jié)果表明CiPSCs是完全重編程為多能性干細胞（Pluripotent stem cells，PSCs）。最后經(jīng)優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)4個基本的小分子化合物（C6FZ）任何一個缺失均會顯著降低GFP陽性克隆率甚至無法獲得CiPSCs。

2 小分子化合物誘導(dǎo)潛能擴展的多能干細胞

PSCs可衍生出兩種功能不同的多能性狀態(tài)，原始態(tài)（naive）和始發(fā)態(tài)（primed）［18］。相比始發(fā)態(tài)PSCs，原始態(tài)PSCs具有更高的發(fā)育潛力［19-20］。始發(fā)態(tài)PSCs具有發(fā)育成三胚層的能力，但其不能發(fā)育到胚外層組織，如滋養(yǎng)層系，而滋養(yǎng)層系有助于胚盤發(fā)育［21］。受精卵和卵裂球在著床前發(fā)育均具有全能性，它們可分化產(chǎn)生胚胎和胚胎外譜系［22］。Yang等［23］根據(jù)鼠基態(tài)多能性條件（PD 0325901，CHIR和人白血病抑制因子（Human leukemia inhibitor factor，hLIF），篩選出一些小分子化合物以支持原始態(tài)。首先篩選出一些小分子化合物來激活Oct4遠端 增 強 子（Oct4 distal enhancer，Oct4-DE），Oct4-DE在胚胎著床前驅(qū)動Oct4基因表達，作為始發(fā)態(tài)多能性的分子標記。另外篩選出小分子化合物抑制TGF-β信號通路，該信號通路對于始發(fā)態(tài)hPSCs的自我更新必不可少。最終發(fā)現(xiàn)兩種小分子化合物，吡啶茚胺馬來酸鹽（（S）-（+）-dimethindene maleate，DiM） 和 鹽 酸 米 諾 環(huán) 素（Minocycline Hydrochloride，MiH）支持圓頂狀hPSCs長期自我更新。經(jīng)過優(yōu)化篩選，研究者建立了由hLIF、CHIR、DiM和MiH（LCDM）4個小分子化合物組成的最優(yōu)培養(yǎng)體系，該體系可以使始發(fā)態(tài)hPSCs轉(zhuǎn)化為具有原始態(tài)特性的圓頂狀hPSCs。LCDM培養(yǎng)體系還可以使hESCs和hiPSCs獲得原始態(tài)特性。LCDM-hPSCs的生長速度快于始發(fā)態(tài)hPSCs，并呈現(xiàn)出更高的單細胞克隆效率，表達多能性標記基因，具備分化出三胚層的能力，具有較高的OCT4-DE活性，雌性細胞系中缺乏組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化位點，表明LCDM-hPSCs具備部分原始態(tài)hPSCs的特征。使用LCDM-mESCs做嵌合體分析發(fā)現(xiàn)，來源于LCDM-mESCs的細胞除了可以整合進入Em組織之外，還能整合進入ExEm組織中，這表明LCDM-mESCs可能具有擴展的發(fā)育能力。

3 小分子化合物誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)分化

鑒于經(jīng)典的iPSCs誘導(dǎo)技術(shù)，研究者相繼利用譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子將體細胞直接重編程為其他類型細胞，如神經(jīng)元細胞、肝臟細胞和心肌細胞等［24-28］。緊接著，小分子化合物誘導(dǎo)體細胞轉(zhuǎn)分化為不同細胞類型開始被探索。Cao等［29］用a肌球蛋白重鏈啟動子驅(qū)動GFP（Alphamyosin heavy chain promoter-driven GFP，aMHC-GFP）標記人包皮成纖維細胞（Human foreskinfibroblast，HFF），使用一些誘導(dǎo)和促進細胞重編程為其他類型細胞的小分子化合物結(jié)合心臟發(fā)生相關(guān)小分子化合物，誘導(dǎo)心臟發(fā)生。首先篩選出89個促進重編程的小分子化合物，隨后將每種小分子化合物分別添加到含SB431542，CHIR，tranylcypromine和FSK的基礎(chǔ)培養(yǎng)體系中，該基礎(chǔ)培養(yǎng)體系在單基因Oct4表達情況下可允許HFF轉(zhuǎn)分化為心肌細胞（Cardiomyocyte cells，CMs），HFF在基礎(chǔ)培養(yǎng)體系中培養(yǎng)6 d 后，轉(zhuǎn)入心臟誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Cardiac induction medium，CIM）中培養(yǎng)5 d，CIM中含心臟發(fā)生小分子化合物激活素A，骨形成蛋白4（Bone morphogeneticprotein 4，BMP4），血管內(nèi)皮細胞生長因子和CHIR，可以提高心臟基因表達。隨后將細胞再轉(zhuǎn)入人CMs條件培養(yǎng)基中進一步成熟。經(jīng)過測試發(fā)現(xiàn)，15個小分子化合物（15C）的組合能誘導(dǎo)得到aMHC-GFP陽性克隆，進一步優(yōu)化條件發(fā) 現(xiàn)，CHIR、A83-01、BIX01294、AS8351、SC1、Y27632和OAC27個小分子化合物（7C）對于有效誘導(dǎo)CMs重編程是必不可少的。另外發(fā)現(xiàn)血小板源生長因子途徑的兩個抑制劑SU16F和JNJ10198409（JNJ），可加速HFF基因的下調(diào)，并且提高了CMs重編程效率。將兩種抑制劑添加到7C中組成9C，可有效地提高誘導(dǎo)CMs重編程效率。研究者將這種化學(xué)誘導(dǎo)的功能性CMs命名為（Chemically induced functional CMs，ciCMs），ciCMs表達心肌細胞標記心肌肌鈣蛋白和心鈉素，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)出有序的心肌小節(jié)，細胞內(nèi)膜電位顯示ciCMs應(yīng)對節(jié)律性鈣瞬變呈現(xiàn)出同步的動作電位，在心臟發(fā)生程序上均較類似于人多能干細胞分化得到的CMs。將ciCMs移植入免疫缺陷鼠心肌梗死的部位，兩周后鼠心肌梗死部位發(fā)生部分再肌化。這些結(jié)果表明ciCMs被高度重編程，且功能類似CMs。

Zhang等［30］使用成纖維細胞特異性蛋白1-Cre/ROSA26tdTomato系統(tǒng)從原代MEFs中排除神經(jīng)組織細胞，經(jīng)流式細胞儀分選獲得的MEFs稱為tdMEFs，作為誘導(dǎo)NSCs的材料。隨后篩選出一些小分子化合物誘導(dǎo)MEFs的神經(jīng)相關(guān)基因表達。BMP I型受體ALK2/3的抑制劑LDN193189和TGF-b I型受體ALK4/5/7的抑制劑A83-01，是抑制中胚層和內(nèi)胚層特化的兩種小分子化合物。GSK3抑制劑CHIR和堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblasts growth factor，bFGF）是支持神經(jīng)發(fā)育的兩種小分子化合物。這四種小分子化合物組合為化學(xué)特定培養(yǎng)基（M4）作為神經(jīng)誘導(dǎo)的基礎(chǔ)條件。Sox2和巢蛋白（Nestin）是NSCs的兩個典型標記基因，MEFs經(jīng)M4培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d 后，未檢測到Sox2+/Nestin+細胞。而在M4中添加Smo拮抗劑Hh-Ag 1.5和維甲酸組成M6后培養(yǎng)MEFs，10 d 后獲得Sox2+/Nestin+細胞。另外，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑RG108，組蛋白去甲基化酶抑制劑tranylcypromine和自噬調(diào)節(jié)劑SMER28可進一步促進Sox2+/Nestin+細胞的產(chǎn)生，將這3個小分子化合物添加到M6中組成M9。M9可有效誘導(dǎo)成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為Sox2+/Nestin+細胞，去除其中任何一種均影響重編程效率。進一步研究發(fā)現(xiàn)M9處理的細胞經(jīng)過一個MET過程，第6天逐漸出現(xiàn)克隆，這些經(jīng)過MET過程的克隆具有AP活性，6 d 后，Sox2基因大量表達，到第10天，NSCs相關(guān)基因包括Pax6、Sox2、Ascl1和Olig2表達。隨后將M9誘導(dǎo)得到的Sox2+/Nestin+細胞轉(zhuǎn)入含bFGF和表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）的常規(guī)NSCs培養(yǎng)基中。這些細胞呈現(xiàn)出指數(shù)增長模式，懸浮培養(yǎng)后可形成神經(jīng)球，細胞周期分布類似于原代神經(jīng)前體細胞（Primaryneural progenitor cells，pri-NPCs）和NSCs。研究者將這種由纖維細胞獲得、增殖速率快、呈Sox2+/Nestin+并可自我更新的細胞命名為化學(xué)誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞樣細胞（Chemical-induced neural stem cell-like cells，ciNSLCs）。ciNSLCs在無 bFGF 和 EGF的分化條件下可分化為Tuj1+神經(jīng)元和GFAP+（glial fibrillary acidic protein）星形膠質(zhì)細胞。

4 展望

小分子化合物誘導(dǎo)細胞類型轉(zhuǎn)換已在人和鼠體內(nèi)實現(xiàn)，通過小分子化合物從體細胞誘導(dǎo)獲得更安全的iPSCs、ciCMs和ciNSLCs，這些誘導(dǎo)細胞為臨床患者特異性治療帶來了希望。但小分子誘導(dǎo)細胞類型轉(zhuǎn)換效率有得提高，這也是目前小分子化合物研究的熱點和難點。此外，細胞重編程的內(nèi)在機制還需進一步明確，從而篩選出更加安全可靠、誘導(dǎo)效率更高的小分子化合物或其他物質(zhì)，從而為疾病治療提供有效的細胞資源。同時，這一研究有望對揭示某些癌癥的誘因并針對性提出相應(yīng)的治療方案提供理論依據(jù)。另外，誘導(dǎo)細胞重編程研究主要集中在人和鼠的物種上，對其他大型哺乳動物如家畜豬牛羊的研究較少，也是未來需要探究的領(lǐng)域。

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