鐵皮石斛轉(zhuǎn)化酶抑制子家族基因的克隆和表達(dá)分析

苗小榮 ?？∑?莫昭展 王愛勤 何龍飛

（1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530005；2. 玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，玉林 537000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，不僅有觀賞價值，而且具有滋陰補(bǔ)腎、生津益胃、潤肺止咳等功效，被稱為“中華九大仙草”之首。多糖是其主要藥理活性物質(zhì)之一，也是目前評判鐵皮石斛品質(zhì)的主要指標(biāo)（中國藥典一部，2015）。蔗糖是多糖合成前體物質(zhì)，它只有分解為葡萄糖和果糖，才能進(jìn)入下游各種代謝途徑，因此研究蔗糖代謝相關(guān)酶活性是研究鐵皮石斛多糖積累的重要組成部分。轉(zhuǎn)化酶（Invertase，INV）是調(diào)節(jié)蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，能不可逆地催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，在蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)、貯藏、分配、以及作物經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量形成與果實(shí)品質(zhì)改良中發(fā)揮重要作用［1］。INV基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的雙重調(diào)控，轉(zhuǎn)化酶抑制子（Invertase inhibitor，InvInh）是轉(zhuǎn)化酶翻譯后酶活性的重要調(diào)節(jié)因子［2］。該類蛋白屬于非糖基化蛋白；具有熱穩(wěn)定性，短時高溫仍具有抑制轉(zhuǎn)化酶活性的作用；對轉(zhuǎn)化酶的抑制作用具有交叉抑制現(xiàn)象；不受低溫、鹽脅迫和成熟等的誘導(dǎo)［3］。

InvInh在轉(zhuǎn)化酶翻譯后水平起調(diào)節(jié)作用，它通過與轉(zhuǎn)化酶結(jié)合，而使轉(zhuǎn)化酶失去活性。與酸性轉(zhuǎn)化酶分類相對應(yīng)，InvInh家族基因也分為液泡轉(zhuǎn)化酶抑制子（Vacuolar invertase inhibitors of β-fructosidase，VIF））和細(xì)胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶抑制子（Cell wall invertase inhibitors of β-fructosidase，CIF），屬 于 INV/PMEI（Invertase and pectin methylesterase inhibitors）家族成員［4］。InvInh對細(xì)胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶（Cell wall invertase，CIN）活性的調(diào)節(jié)是通過碳源實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)碳源有限時，InvInh能抑制CIN酶活性，此時蔗糖合成酶主要起分解蔗糖作用。當(dāng)蔗糖濃度充足時，CIN才被激活。InvInh只與“空閑”的CIN結(jié)合，可保護(hù)“空閑”的CIN免遭降解，具有分子伴侶的功能［5］。番茄CIN（LIN5）和CIF基因存在于篩管的細(xì)胞壁上［6］。InvInh和INV以離子鍵相結(jié)合，將InvInh酶加入煙草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，該酶可以在細(xì)胞壁上自由移動，能與CIN酶結(jié)合形成InvInh/CIN復(fù)合物，從而抑制CIN酶活性。在pH 4.5時，擬南芥AtCIF與CIN的結(jié)合量最大。在該pH值條件下，CIF與蔗糖競爭INV的同一結(jié)合位點(diǎn)，CIF能與CIN緊密結(jié)合，使CIN失去酶活性［7］。InvInh酶活性具有劑量依賴型的抑制作用，其使轉(zhuǎn)化酶酶活性降低50%的Ki值為3.82×10-5mol/L［8］。此外，InvInh基因在馬鈴薯“低溫糖化”過程中也發(fā)揮重要作用。在4℃低溫脅迫下，馬鈴薯StINV1/StInvInh2基因的相對表達(dá)量與塊莖中還原糖的積累呈顯著的相關(guān)性，StInvInh2通過抑制StINV1酶活性，調(diào)節(jié)塊莖中還原糖的含量變化，以適應(yīng)低溫環(huán)境［9］。在低溫儲藏過程中過量表達(dá)StInvInh2基因，能增加冷敏感型馬鈴薯塊莖中InvInh酶活性，降低液泡轉(zhuǎn)化酶活性，降低還原糖含量［10］。

本研究根據(jù)課題組前期構(gòu)建的鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，從中篩選到3個InvInh基因，采用 RT-PCR和RACE方法克隆其全長cDNA序列（分別命名為DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3）。同時，利用生物信息學(xué)軟件分析該蛋白家族基因的理化特性和蛋白結(jié)構(gòu)，采用實(shí)時熒光定量PCR方法分析DoInvInh家族基因成員在鐵皮石斛不同組織部位中的表達(dá)，旨為研究InvInh家族基因?qū)D(zhuǎn)化酶的抑制機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 鐵皮石斛取自玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院觀賞經(jīng)濟(jì)植物培育基地。以鐵皮石斛幼嫩葉片cDNA為材料進(jìn)行基因克隆。于2016年5月10日分別取2年生的鐵皮石斛根、莖、葉和花，以及1-3年生鐵皮石斛的莖為材料。液氮速凍后，用于RNA提取的材料置-80℃保存，用于酶活性測定的材料置于-20℃保存。

1.1.2 試劑 RNA提取Trizol試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；5￠RACE試劑盒購于Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ex Taq酶、dNTPs、pMD18-T載 體、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、Genome Walking Kit、SYBR Premix Ex Tap II購自TaKaRa寶生物工程（大連）公司。本試驗(yàn)所用特異引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實(shí)時熒光定量PCR采用ABI Stepone Plus型熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 以鐵皮石斛幼嫩葉為材料提取總RNA，RNA提取采用天根Trizol-A+提取液，具體提取過程參照Trizol試劑盒說明書。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，利用Thermo Scientific Nanodrop 2000c檢測總RNA濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄按照ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。

1.2.2 鐵皮石斛InvInh基因克隆和拼接驗(yàn)證 從鐵皮石斛葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到3個 InvInh基因核苷酸序，DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3序列大小分別為 928 bp、722 bp和488 bp，經(jīng)NCBI ORF Finder在線預(yù)測和同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)DoInvInh1和DoInvInh2基因已經(jīng)獲得全長基因序列，而DoInvInh3基因在3'片段還缺少大約90 bp 核苷酸序列，通過設(shè)計引物，采用3'RACE技術(shù)進(jìn)行基因克隆。

依據(jù)DoInvInh3基因中間片段的核苷酸序列，設(shè)計用于3'端擴(kuò)增的2條特異上游引物：XYF1和XYF2（表1）。以提取的鐵皮石斛葉總RNA為模板，按照ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書，以GZS（5'- GGCCACGCGTCGACTAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'）作為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。用XYF1和XYR1引物進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物稀釋20倍后作為引物XYF2和XYR1的模板，進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序 ：94℃ 5 min；94℃ 50 s，57℃ 30 s，72℃ 1.30 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體并測序，測序結(jié)果246 bp。利用ContigExpress軟件將3'序列和中間片段核苷酸序列進(jìn)行拼接后，獲得了DoInvInh3全長cDNA序列。在DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3基因的編碼區(qū)序列兩端，分別設(shè)計引物：F1和R1、F2和R2、F3和R3進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，引物序列如表1所示。擴(kuò)增體系為25 μL（下同）：Ex Taq酶0.25 μL、2×GC Buffer II 12.5 μL、2.5 mmol L-1dNTPs 1.5 μL、10 mmol/L 上下游引物各 1 μL，模板 cDNA 1 μL和ddH2O 7.75 μL。DoInvInh1 PCR反應(yīng)體系：94℃ 5 min ；94℃ 50 s，58℃ 30 s，72℃ 1min，35 個循環(huán) ；72℃延伸10 min。DoInvInh2和DoInvInh3 PCR擴(kuò)增時的退火溫度分別為57℃和56℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，經(jīng)菌液PCR檢測正確后送深圳華大測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用http://web.expasy.org/protparam分析編碼蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點(diǎn)；利用http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html分析跨膜結(jié)構(gòu)；利用MEGA6.0軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP分析蛋白的亞細(xì)胞定位；利用http://smart.embl-heidelberg.de進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用Vector NTI Advance 11.0進(jìn)行氨基酸序列同源性比對分析；利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP分析蛋白信號肽；利用http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan分析蛋白的活性位點(diǎn)。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物

1.2.4 基因表達(dá)、轉(zhuǎn)化酶酶活性和還原糖含量的測定 依據(jù)3個DoInvInh基因的全長cDNA核苷酸序列，設(shè)計用于實(shí)時熒光定量PCR的引物：TF1和TR1、TF2和TR2、TF3和TR3（表1）。以持家基因Actin為內(nèi)參基因，引物序列參照蔣園等［11］的方法。利用熒光染料法進(jìn)行實(shí)時熒光定量表達(dá)分析，反應(yīng)參數(shù)：95℃ 30 s，一個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 20 s，共45個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，分析基因的相對表達(dá)量。莖中還原糖含量的測定，采用硫酸蒽酮法?？扇苄运嵝赞D(zhuǎn)化酶（Soluble acid invertase，SAI）和細(xì)胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶（Cell wall invertase，CIN）酶活性的提取和測定參照牛俊奇等［12］的方法。利用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用 Duncan 新復(fù)極差法，顯著水平為0.05。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛InvInh家族基因的克隆和序列分析

DoInvInh1、DoInvInh2和 DoInvInh3基因的 編碼區(qū)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）。其序列測序結(jié)果分別為531 bp、534 bp和537 bp，與預(yù)測的大小相符，與從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出的InvInh基因的同源性都在99.5%以上，說明拼接結(jié)果正確。DoInvInh1基因cDNA序列全長928 bp，包含6 bp 的5'非翻譯區(qū)（Untranslated Regions，UTR），391 bp的 3'UTR和 1個531 bp開放閱讀框（Open reading frame，ORF），編碼176 個氨基酸。DoInvInh2基因cDNA序列全長722 bp，包含84 bp的5'UTR，104 bp的3'UTR和1個534 bp的ORF，編碼177 個氨基酸。DoInvInh3基因 cDNA序列全長674 bp，包含32 bp的5'UTR，105 bp的3'UTR和1個534 bp的ORF，編碼178 個氨基酸。這3個DoInvInh基因已在GenBank數(shù)據(jù)庫注冊，其注冊號為KY947274- KY947276（表2）。

2.2 DoInvInh家族基因成員的編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)分析

圖1 鐵皮石斛3個DoInvInh基因ORF序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

利用ProtParam對3個DoInvInh蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，預(yù)測分子量在18.38-18.84 kD，等電點(diǎn)在4.4-6.25。DoInvInh2蛋白和DoInvIn3蛋白的等電點(diǎn)比較接近，都在6.0以上，而DoInvInh1蛋白的等電點(diǎn)較低，為4.4。3個DoInvInh基因核苷酸序列同源率在49%-60%之間，氨基酸序列同源性在28%-41%之間，其中DoInvInh2蛋白的氨基酸與DoInvIn3蛋白的氨基酸序列同源性比較高，為41%，而DoInvInh2和DoInvIn3之間氨基酸序列同源性較低，為28%（表2）。3個DoInvInh蛋白的親水性指數(shù)為0.06-0.121，為疏水性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)在30.49-48.01之間，為不穩(wěn)定蛋白；都具有2個跨膜結(jié)構(gòu)和PMEI蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。在N端都具有一個1-23 bp信號肽序列；Target P1.1在線軟件預(yù)測3個DoInvInh蛋白都屬于分泌型蛋白，其可能性為分別為0.931、0.712和0.959；利用Motif Scan Results進(jìn)行蛋白活性位點(diǎn)的分析，3個DoInvInh蛋白都具有糖基化位點(diǎn)、絡(luò)蛋白激酶 II磷酸化位點(diǎn)、豆蔻?；稽c(diǎn)和蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。

2.3 DoInvInh家族蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖2）顯示3個DoInvInh蛋白都含有7個α-螺旋，不含β-折疊。在DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3 蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋分別占80%，79%和79%，無規(guī)則卷曲分別占23%、21%和20%，跨膜螺旋分別占9%、10%和9%，且3個跨膜螺旋都位于第7個α-螺旋上。利用Phyre2預(yù)測三級結(jié)構(gòu)，3個DoInvInh蛋白的具有相似的三級空間結(jié)構(gòu)。

表2 鐵皮石斛InvInh蛋白的分子特性和同源性

圖2 DoInvInh蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 不同物種間InvInh基因所編碼蛋白質(zhì)的同源性分析

運(yùn)用Vector NTI Advance 11 軟件上的AlignX對10種（鐵皮石斛、擬南芥、甜瓜、黃瓜、馬鈴薯、大麥、水稻、高粱、甘蔗和玉米）植物的12個InvInh蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對分析（圖3）。InvInh蛋白的氨基酸序列在不同植物間保守性較差，不同物種間氨基酸序列的同源性在20%-50%之間。但所選的InvInh蛋白都具有10個保守的氨基酸，分別是1個丙氨酸Ala、1個絡(luò)氨酸Tyr、2個賴氨酸Leu、4個保守的半胱氨酸Cys位點(diǎn)和1個保守SP位點(diǎn)（絲氨酸Ser和脯氨酸Pro）。結(jié)合DoInvInh蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析，4個Cys位點(diǎn)分別位于第2，第3，第5和第6個 α-螺旋上。

2.5 DoInvInh家族基因成員在鐵皮石斛不同部位中的表達(dá)分析

熒光定量PCR分析表明，DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3基因在鐵皮石斛根、莖、葉和花中均有表達(dá)，且具有一定的組織表達(dá)特異性（圖4）。DoInvInh1基因在莖中表達(dá)量最高，葉中次之，在花中最低，其中該基因在莖中表達(dá)量分別是葉和花中基因表達(dá)量的2.09倍和5.99倍。DoInvInh2和DoInvInh3基因在鐵皮石斛不同部位表達(dá)模式相似，都是在花中表達(dá)量最高，根中表達(dá)量最低。DoInvInh2和DoInvInh3在花中基因的表達(dá)量分別是根中基因表達(dá)量的3.97倍和4.07倍。DoInvInh2基因在莖中基因表達(dá)量高于葉中基因表達(dá)量，而DoInvInh3基因則相反。

2.6 不同生長年限鐵皮石斛莖中InvInh基因表達(dá)量、轉(zhuǎn)化酶和還原糖含量的變化分析

在3年生鐵皮石斛植株中，DoInvInh1和DoInvInh3基因在莖中的表達(dá)模式相同，其基因表達(dá)量都呈“1年生莖＞2年生莖＞3年生莖”（圖5），DoInvInh1和DoInvInh3基因在1年生莖中基因表達(dá)量分別是3年生莖中基因表達(dá)量的3.84和3.55倍。DoInvInh2基因在2年生莖中基因表達(dá)量最高，1年生莖中次之，3年生莖中最低。其中2年生莖中基因表達(dá)量分別是1年生莖和3年生莖中基因表達(dá)量的1.79倍和3.40倍。

1年生莖中可溶性糖含量顯著高于2年生和3年生莖中的可溶性糖含量（圖6），而2年生莖與3年生莖中可溶性糖含量差異不顯著。SAI酶活性在鐵皮石斛不同生長年限的莖中表達(dá)模式呈“ 1年生莖＞2年生莖＞3年生莖”（圖7），其中1年生莖中SAI酶活性是3年生莖中的1.43倍，達(dá)到差異顯著水平。而CIN酶活性則相反，呈“ 3年生莖＞2年生莖＞1年生莖”，CIN酶在3年生莖中的酶活性分別是1年生莖和2年生莖中酶活性的4.69和1.57倍，且酶活性均達(dá)到差異顯著水平（圖8）。相關(guān)性分析表明，莖中可溶性糖與SAI酶活性呈顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.944。CIN與SAI酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.997。DoInvInh1和DoInvInh3基因表達(dá)量與CIN酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.948和-0.946。

3 討論

隨著核苷酸測序技術(shù)的不斷發(fā)展，植物轉(zhuǎn)錄組成為一個新的研究熱點(diǎn)?；诟咄哭D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析研究，將有助于獲得新的功能基因，為種質(zhì)資源鑒定、保存、擴(kuò)大與優(yōu)良種質(zhì)選育奠定分子基礎(chǔ)。本研究在鐵皮石斛葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，采用PCR技術(shù)首次從鐵皮石斛中克隆出3個DoInvInh基因，它們所編碼蛋白都具有保守的PMEI結(jié)構(gòu)域，都屬于INV/PMEI家族基因成員。3個DoInvInh蛋白N端都具有4個不對稱的α-螺旋結(jié)構(gòu)和4個保守的Cys位點(diǎn)，它們在穩(wěn)定InvInh蛋白構(gòu)型和功能中起作用。4個α-螺旋在維持InvInh蛋白結(jié)構(gòu)的完整性中起重要作用，而4個α-螺旋結(jié)合區(qū)是與酸性轉(zhuǎn)化酶結(jié)合的重要區(qū)域［13］。不同物種InvInh蛋白的氨基酸序列差異較大，即使在同一物種內(nèi)其氨基酸序列也不保守，但都包含4個保守的Cys［14］。3個DoInvInh蛋白推測的三級結(jié)構(gòu)相似，其中第1和第2個Cys形成分子內(nèi)第1個二硫鍵，第3和第4個Cys形成分子內(nèi)第2個二硫鍵。二硫蘇糖醇（DTT）能破壞分子內(nèi)二硫鍵，使InvInh失去抑制作用。煙草抑制子在高溫和低pH值下能保持穩(wěn)定，就是由于Cys間形成了分子內(nèi)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的二硫橋的緣故［15］。

圖3 DoInvInh蛋白與其他植物InvInh蛋白的多序列比對

圖4 三個DoInvInh基因在鐵皮石斛不同部位中的表達(dá)分析

圖5 鐵皮石不同生長年限莖中InvInh基因的表達(dá)分析

圖6 鐵皮石斛不同生長年限莖中可溶性糖含量分析

圖7 鐵皮石不同生長年限莖中SAI酶活性分析

圖8 鐵皮石不同生長年限莖中CIN酶活性分析

基因的表達(dá)模式分析可為基因功能的揭示提供重要線索。通過RNAi沉默大豆GmCIF基因的表達(dá)，能提高CIN酶活性，增加種子重量，同時能提高成熟種子中己糖、淀粉和蛋白質(zhì)的含量［16］。番茄（SiVIF）通過與液泡轉(zhuǎn)化酶（SiVI）相互作用，來調(diào)節(jié)蔗糖代謝過程，進(jìn)而影響果實(shí)成熟。采用RNAi技術(shù)沉默番茄SlVIF基因的表達(dá)，番茄果實(shí)成熟延遲，而過表達(dá)SlVIF可以加速番茄果實(shí)成熟［17］。擬南芥AtCIF1基因定位于非原質(zhì)體，在CIF缺少的突變體中，種子萌發(fā)后的24 h內(nèi)CIN酶活性和己糖含量都顯著升高。而在過表達(dá)AtCIF1的擬南芥植株中，CIN酶活性受到抑制，能推遲種子萌發(fā)。AtCIF1在翻譯后水平調(diào)節(jié)CIN酶活性，通過調(diào)節(jié)蔗糖水解和糖信號，促進(jìn)擬南芥種子萌發(fā)和早期生長［18］。本研究結(jié)果也表明，鐵皮石斛莖中DoInvInh1和DoInvInh3基因表達(dá)量與CIN酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，說明這2個基因可能具有抑制CIN酶活性的作用。而通過上述轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)也證明過量表達(dá)InvInh基因，能抑制轉(zhuǎn)化酶活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)蔗糖代謝和庫強(qiáng)。

在擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞中過量表達(dá)煙草CIF基因，與野生型相比保衛(wèi)細(xì)胞液泡轉(zhuǎn)化酶酶活性、氣孔和電導(dǎo)度都降低了，但抗旱能力提高了［19］。同時，RNAi抑制煙草CIN酶活性，能促進(jìn)碳水化合物的消耗，降低合成次級代謝產(chǎn)物的能力［20］。以上實(shí)驗(yàn)均表明InvInh在對轉(zhuǎn)化酶酶活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，因此從分子水平上對InvInh基因研究的不斷深入，能使人們逐漸從本質(zhì)上了解該基因的組成、結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)理，為更好的調(diào)節(jié)其在植物中的表達(dá)和酶活性，改變庫組織的蔗糖輸入速率及同化物的分配和改善品質(zhì)提供依據(jù)和技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本研究從鐵皮石斛中克隆到3個InvInh基因，它們編碼的蛋白都具有1個信號肽、2個跨膜結(jié)構(gòu)和PMEI蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。DoInvInh蛋白都具有4個保守的Cys位點(diǎn)和SP位點(diǎn)，氨基酸序列同源性較低。3個DoInvInh基因在根、莖、葉和花均有表達(dá)，且表達(dá)模式不同。鐵皮石斛不同生長年限莖中DoInvInh1和DoInvInh3基因的表達(dá)模式相似，在1年生莖中表達(dá)量最高，2年生莖中次之，3年生莖中最低。DoInvInh1和DoInvInh3基因表達(dá)量與CIN酶活性都呈顯著負(fù)相關(guān)，推測這2個基因可能在調(diào)節(jié)莖中CIN酶活性中起作用。

［1］ Sturm A. Invertases：primary structures, functions and roles in plant development and sucrose partitioning ［J］. Plant Physiol, 1999, 121（1）：1-8.

［2］ Jin Y, Ni DA, Ruan YL. Posttranslational elevation of cell wall invertase activity by silencing its inhibitor in tomato delays leaf senescence and increases seed weight and fruit hexose level ［J］.Plant Cell, 2009, 21（7）：2072-2089.

［3］ 成善漢, 柳俊, 謝從華, 等. 植物轉(zhuǎn)化酶抑制子及其分子生物學(xué)的研究進(jìn)展 ［J］. 海南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2007, 25（1）：83-87.

［4］ Rausch T, Greiner S. Plant protein inhibitors of invertases ［J］.Biochim Et Biophys Acta, 2004, 1696（2）：253-261.

［5］ Krausgrill S, Greiner S, K?ster U, et al. In transformed tobacco cells the apoplasmic invertase inhibitor operates as a regulatory switch of cell wall invertase ［J］. Plant J, 1998, 13（2）：275-280.

［6］ Palmer W, Ru L, Jin Y, et al. Tomato ovary-to-fruit transition is characterized by a spatial shift of mRNAs for cell wall invertase and its Inhibitor with the encoded proteins localized to sieve elements ［J］.Mol Plant, 2015, 8（2）：315-328.

［7］ Hothorna M, Ende WVD, Lammens WL, et al. Structural insights into the pH-controlled targeting of plant cell-wall invertase by a specific inhibitor protein ［J］. Proc Nati Acad Sci USA, 2010, 107（40）：17427-17432.

［8］ Huang GJ, Sheu MJ, Chang YS, et al. Isolation and characterisation of invertase inhibitor from sweet potato storage roots ［J］. J Sci Food Agr, 2008, 88（15）：2615-2621.

［9］ Liu X, Song BT, Zhang HL, et al. Cloning and molecular characterization of putative invertase inhibitor genes and their possible contributions to cold-induced sweetening of potato tubers［J］. Molecular Genetics Genomics, 2010, 284（3）：147-159.

［10］ Mckenzie MJ, Chen RKY, Harris JC, et al. Post-translational regulation of acid invertase activity by vacuolar invertase inhibitor affects resistance to cold-induced sweetening of potato tubers ［J］.Plant Cell Environ, 2013, 36（1）：176-185.

［11］ 蔣園, 朱玉球, 高燕會, 等. 鐵皮石斛WRKY5基因的克隆與表達(dá)分析 ［J］. 中草藥, 2016, 47（2）：301-308.

［12］ ?？∑? Phan Thi Thu, 邵敏, 等. 甘蔗工藝成熟期轉(zhuǎn)化酶及其抑制子與蔗糖積累的相關(guān)性研究 ［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2015,28（4）：1606-1611.

［13］ Greiner S, Krausgrill S, Rausch T. Cloning of a tobacco apoplasmic invertase inhibitor. Proof of function of the recombinant protein and expression analysis during plant development ［J］. Plant Physiol,1998, 116（2）：733-742.

［14］ 牛俊奇, 黃靜麗, 張琨琨, 等. 甘蔗轉(zhuǎn)化酶抑制子（SoInvInh1）基因克隆和表達(dá)分析 ［J］. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 20（3）：38-45.

［15］ Hothorn M, Wolf S, Aloy P, et al. Structural insights into the target specificity of plant invertase and pectin methylesterase inhibitory proteins ［J］. Plant Cell, 2014, 16（12）：3437-3447.

［16］ Tang X, Tao S, Mei H, et al. Suppression of extracellular invertase inhibitor gene expression improves seed weight in soybean（Glycine max） ［J］. J Exp Bot, 2017, 68（3）：469-482.

［17］ Qin G, Zhu Z, Wang W, et al. A tomato vacuolar invertase inhibitor mediates sucrose metabolism and influences fruit ripening ［J］.Plant Physiol, 2016, 172（3）：1596-1611.

［18］ Su T, Wolf S, Han M, et al. Reassessment of an Arabidopsis cell wall invertase inhibitor AtCIF1 reveals its role in seed germination and early seedling growth ［J］. Plant Mol Biol, 2016, 90（1）：137-155.

［19］ Chen SF, Liang K, Yin DM, et al. Ectopic expression of a tobacco vacuolar invertase inhibitor in guard cells confers drought tolerance in Arabidopsis ［J］. J Enzyme Inhib Med Ch, 2016, 31（6）：1381-1385.

［20］ Ferrieri AP, Arce CC, Machado RA, et al. A Nicotiana attenuata cell wall invertase inhibitor（NaCWII）reduces growth and increases secondary metabolite biosynthesis in herbivore-attacked plants ［J］. New Phytol, 2015, 208（2）：519-530.