主動脈夾層患者高密度脂蛋白亞類功能變化研究

王振坤,李鵬,聶炳榮,劉辰,何婧

主動脈夾層在急性期致殘率及死亡率高，是一種災(zāi)難性血管性疾病。目前對于主動脈夾層的病因和發(fā)病機制仍不明確，普遍認為主動脈夾層是多種因素的共同作用而發(fā)病。有研究表明近50%以上的主動脈夾層患者合并有血脂異常[1]。高密度脂蛋白（HDL）是血脂中重要一員，其亞類主要由HDL2及HDL3組成，具有促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運、抗氧化、抗炎等多種功能，與高血壓、動脈粥樣硬化關(guān)系密切，同時高血壓、動脈粥樣硬化均是主動脈夾層的重要病因，而對于HDL同主動脈夾層之間是否存在聯(lián)系目前尚少見報道。為此，本研究通過檢測主動脈夾層患者HDL亞類各功能即促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運（RCT）功能[測巨噬細胞[3H]膽固醇轉(zhuǎn)出率]、抗氧化功能[測對氧磷脂酶1（PON1）活性]、抗炎功能[測細胞間黏附分子1（ICAM-1）及血管內(nèi)細胞黏附因子1（IVCAM-1）]，以明確主動脈夾層患者其HDL亞類功能變化情況，為主動脈夾層的預(yù)防及治療提供一個可能新的方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2013-01至-2015-01我院確診的急性主動脈夾層患者60例作為主動脈夾層組，其中男性44例，女性16例，年齡26～64歲；健康體檢者60例患者作為健康對照組，其中男性38例，女性22例，年齡25～60歲。

1.2 診斷標準

急性主動脈夾層診斷標準：根據(jù)臨床表現(xiàn)，如急性胸痛合或背痛，經(jīng)增強計算機斷層掃描（CT）或磁共振成像（MRI）檢查顯示主動脈內(nèi)膜撕裂將主動脈夾層分為真假兩腔，即可確診。

1.3 血脂測定

晨起空腹抽取肘靜脈血2 ml，置于普通生化采血管中，靜置30 min 后離心取血清，置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用酶法在全自動生化儀上測定血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）。

1.4 HDL亞類（HDL2及HDL3）測定

參照文獻[2]方法。1.06 mol/l MnCl2·4H2O溶于蒸餾水，加水至終體積1 L，后將490 mg肝素鈉鹽溶于2 ml蒸餾水，取1.5 ml溶液溶入上述25 ml溶液中配成肝素/ MnCl2溶液。3 ml血漿中加入0.3 ml肝素/ MnCl2混勻，室溫下放置15 min左右。以1 500 g在4℃下離心1 h，取出部分透明上層清液進行總HDL測定，并進行下一步操作。1.43 g硫酸右旋糖酐溶于0.15 mol/L NaCl中，并用0.15 mol/L Nacl加至100 ml配成硫酸右旋糖酐溶液。在2 ml上層清液中加入0.2 ml硫酸右旋糖酐溶液，混勻，室溫下放置20 min。以1 500 g在4℃下離心30 min，取出部分透明上清液進行HDL3測定。HDL2濃度則等于總HDL減去HDL3濃度。

1.5 [3H]膽固醇轉(zhuǎn)出率的測定

參照文獻[3，4]方法，將J774巨噬細胞接種在24孔細胞培養(yǎng)板上，以DMEM/F12 培養(yǎng)液（含0.2%BSA，細胞濃度2×105個/ml）于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)液中分別加入[3H]膽固醇（1 μCi/ml）及氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL，30 μg/ml）促進細胞對[3H]膽固醇的吸收，培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基并以DMEM/F12 培養(yǎng)液洗滌1次后，再次加入DMEM/F12全培養(yǎng)液、環(huán)磷酸腺苷（cAMP，0.3 mmol/L）培養(yǎng) 12 h 后，加入 apoA1（10 μg /ml）4 h以促進[3H]膽固醇轉(zhuǎn)出，細胞用PBS平衡鹽溶液洗滌并用NaOH（0.1 mol）完全溶解，最后利用液閃計數(shù)儀檢測細胞溶解物及細胞介質(zhì)的[3H]放射量。[3H]膽固醇轉(zhuǎn)出率用細胞介質(zhì)中[3H]膽固醇放射量占總放射量（細胞內(nèi)＋細胞介質(zhì)）的百分比表示。

1.6 血清對PON1活性測定

根據(jù)Tang等[5]的方法。1.3 ml反應(yīng)緩沖液（2 mmol/L CaCl2， 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0），加入 5 mmol/L的乙酸苯酯150 μl，于25℃預(yù)溫20 min后，加入用緩沖液稀釋到1：10的血清50 μl（稀釋液為反應(yīng)緩沖液），反應(yīng)90 s。分光光度計于270 nm波長測定吸光度值。酶活性計算公式如下：PON1活性=A×f×FV×103/（t×SV×L×ε）。A為凈吸光度值（即標本吸光度-血清對照和底物對照的吸光度值），f為標本稀釋倍數(shù)，F(xiàn)V為反應(yīng)終體積，t為反應(yīng)時間，SV為樣品體積，L為光徑，ε為摩爾消光系數(shù)。

1.7 ICAM-1及IVCAM-1的測定

將人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）種入細胞培養(yǎng)板（細胞濃度5×105cells/ml），培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，而后加入健康體檢者、主動脈夾層患者的HDL（1 mg/ml），孵育4 h后加入腫瘤壞死因子α（10 ng/ml），刺激4 h后中止反應(yīng)，抗人CD54-PE和 CD106-FITC單克隆抗體標記后，流式細胞儀檢測平均熒光強度獲得 ICAM-1和IVCAM-1的表達水平。1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料 以±s表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者基線資料比較（表1）

兩組受試者年齡、TC、TG、LDL-C、HDL-C差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；主動脈夾層組血壓水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 兩組受試者基線資料比較（±s）

表1 兩組受試者基線資料比較（±s）

注：與健康對照組比較aP＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

項目健康對照組(n=60)主動脈夾層組(n=60)年齡 (歲) 52.2±10.5 51.8±9.8甘油三酯 (mmol/L) 1.55±0.78 1.42±0.49總膽固醇 (mmol/L) 4.89±0.66 5.03±0.76低密度脂蛋白膽固醇 (mmol/L) 3.19±0.75 3.33±0.81高密度脂蛋白膽固醇 (mmol/L) 1.42±0.30 1.34±0.43收縮壓(mmHg) 114.09±11.60 154.17±10.36a舒張壓(mmHg) 69.86±7.52 89.49±9.19a

2.2 兩組受試者血漿HDL2及HDL3比較

與健康對照組相比，主動脈夾層組HDL2水平 降 低 [（41.15±19.02） mmol/L vs（60.48±22.19）mmol/L ，P=0.010]，HDL3 水平升高 [（58.85±29.97）mmol/L vs（39.52±30.15） mmol/L ，P=0.013]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 兩組受試者HDL亞類介導(dǎo)的巨噬細胞[3H]膽固醇轉(zhuǎn)出率比較

主動脈夾層組巨噬細胞[3H]膽固醇轉(zhuǎn)出率（5.79±0.97）%低于健康對照組（11.45±2.15）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 01）。

2.4 兩組受試者PON1活性比較

主動脈夾層組PON1活性（125.62±9.90）μ/ml低于健康對照組（158.72±13.27）μ/ml，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 兩組受試者HUVEC表達ICAM-1及IVCAM-1的平均熒光強度比較

與健康對照組相比，主動脈夾層組ICAM-1平均熒光強度 [（33 571.85±2 529.97）vs（17 239.52±4 330.15）]及 IVCAM-1平均熒光強度[（442.15±119.02）vs（260.48±92.19]均較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

主動脈夾層是一種病情兇險、進展快、死亡率高的疾病。主動脈夾層始發(fā)于主動脈壁內(nèi)膜和中層撕裂形成內(nèi)膜撕裂口，主動脈腔內(nèi)血液經(jīng)內(nèi)膜撕裂口直接穿透病變中層，將中層分離成夾層。目前其發(fā)病機制尚未十分明確，現(xiàn)公認的危險因素有高血壓、動脈粥樣硬化（AS）、炎癥性疾病、基因遺傳性疾病、醫(yī)源性損傷、妊娠等[6，7]。對于血脂與主動脈夾層的關(guān)系目前尚未有定論，有研究認為血脂高者，主動脈夾層發(fā)生率低，而血脂過度降低易發(fā)生主動脈夾層，理由是膽固醇是合成動脈中層平滑肌細胞（SMC）膜必需成分；甘油三酯分解產(chǎn)物游離脂肪酸（FFA）是肌細胞的能源供應(yīng)體，所以當(dāng)脂質(zhì)缺乏時則SMC代謝失控，代謝產(chǎn)物堆積，彈力纖維發(fā)生變性或壞死，主動脈壁易受損，易導(dǎo)致主動脈夾層生成。但本研究顯示主動脈夾層患者血脂同健康對照組相比較無明顯差異，提示單純的各血脂濃度可能并不能完全揭示與主動脈夾層的關(guān)系，各血脂成分其功能變化也許比其濃度變化更重要。

HDL-C是血脂重要成分，具有保護心血管的作用，是抗AS和冠心病的一個獨立因素，但應(yīng)用升高血漿HDL-C水平的藥物，如膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑并不能降低心血管事件發(fā)生率，提示可能是HDL功能而不是HDL-C水平起關(guān)鍵作用。有研究[8]表明HDL亞類功能可獨立于HDL-C水平更好地預(yù)測AS和冠心病發(fā)生風(fēng)險。HDL是一個復(fù)雜的多功能蛋白復(fù)合體，其亞類主要以HDL2和HDL3為主，HDL2為大的、密度較小、成熟的顆粒，HDL3為小的、密度較大、未成熟的顆粒[9]。目前認為HDL的心血管保護作用很大程度上是由于它介導(dǎo)RCT[10]。HDL將膽固醇從周圍組織（包括粥樣斑塊）轉(zhuǎn)運到肝臟代謝，這一過程就稱RCT，通過RCT可減少脂質(zhì)在血管壁的沉積。RCT過程是HDL由小顆粒轉(zhuǎn)變成大顆粒的成熟代謝過程，即preβ→HDL→HDL3→HDL2。研究表明HDL2較HDL3具有更好的心血管保護作用，但亦有部分研究提示二者具有同等程度的心血管保護作用[11，12]。本研究證實，主動脈夾層患者HDL2水平下降，HDL3水平升高，且RCT能力下降；提示主動脈夾層患者HDL亞類顆粒變小，其代謝成熟過程受阻，引起RCT減弱，導(dǎo)致主動脈血管壁膽固醇沉積，易致粥樣斑塊形成，主動脈夾層發(fā)生概率增加；同時也證實HDL2可能較HDL3具有更好的心血管保護作用。

HDL的心血管保護作用除了RCT，另外還具有抗炎、抗氧化等功能[13]，同樣也發(fā)揮重要作用，而ICAM-1及IVCAM-1、PON1可準確反映HDL的抗炎、抗氧化功能。近年來國內(nèi)外有基礎(chǔ)實驗和臨床研究均證實了主動脈夾層發(fā)生發(fā)展過程中有炎癥反應(yīng)參與，部分炎癥性疾病是主動脈夾層危險因素。C反應(yīng)蛋白（CRP）是經(jīng)典的心血管疾病預(yù)測因子，參與了炎癥過程，其可誘導(dǎo)ICAM-1、IVCAM-1的產(chǎn)生，而研究發(fā)現(xiàn)HDL可抑制CRP誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞黏附分子的表達[14]。本研究從抑制黏附分子表達證實，主動脈夾層組患者HDL抑制ICAM-1及IVCAM-1表達能力較健康對照組明顯下降，表明其HDL抗炎功能減弱。PON1是HDL上的重要抗氧化酶，與高血壓及動脈粥樣硬化均關(guān)系密切。研究表明，敲除鼠其PON1，即使在正常血脂狀態(tài)下，也會出現(xiàn)血管壁炎性反應(yīng)增加和脂質(zhì)過氧化物堆積，從而導(dǎo)致AS[15]。本研究顯示主動脈夾層患者PON1活性下降，表明其HDL抗氧化能力減弱。

本研究的不足之處：研究未設(shè)立單純高血壓組，需深入的研究進行改進。

綜上所述，本研究證實主動脈夾層患者血脂各濃度水平無明顯變化，但HDL亞類功能發(fā)生明顯變化，其RCT、抗炎、抗氧化功能減弱，易引起血管壁脂質(zhì)沉積、炎性反應(yīng)增加、脂質(zhì)過氧化物堆積，可產(chǎn)生血壓升高及動脈粥樣硬化、血管壁炎性病變等多種危險因素，最終使主動脈夾層發(fā)生率升高。

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