細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3在腫瘤中的研究進(jìn)展

劉 娟 綜述 張澍田 審校

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(Cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3)是一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，可直接或間接與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent protein kinase，CDK)及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子等相互作用，參與細(xì)胞周期調(diào)控。由于調(diào)控細(xì)胞周期的基因表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)腫瘤的靶向治療意義重大[1-2]，因此，CDKN3在腫瘤中的功能及機(jī)制研究越來(lái)越廣泛。然而，隨著對(duì)CDKN3研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在不同類型腫瘤組織中發(fā)揮不同作用，不僅參與細(xì)胞周期調(diào)控，對(duì)細(xì)胞凋亡及侵襲遷移能力也有影響。由此，本文通過(guò)對(duì)CDKN3在腫瘤中的作用機(jī)制研究結(jié)果進(jìn)行回顧，從CDKN3在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡及侵襲遷移中的作用、CDKN3突變體及其亞細(xì)胞定位四個(gè)方面對(duì)CDKN3在腫瘤中抑癌/促癌機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行概述，為下一步基礎(chǔ)及臨床研究提供思路，從而促進(jìn)CDKN3的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，以提高腫瘤的臨床診治水平。

1 CDKN3基因概述

CDKN3基因最早于1994年由Hannon等應(yīng)用酵母雙雜交體系研究與CDK2相互作用蛋白時(shí)從HeLa細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，因其可與CDK結(jié)合，曾被命名為KAP(CDK-associated phosphatase)，該研究發(fā)現(xiàn)KAP為雙特異性磷酸酶，在酵母中可與CDK2和CDC2相互作用，且在哺乳動(dòng)物中更傾向于與CDC2結(jié)合[3]。1995年通過(guò)FISH技術(shù)定位其染色體位置為14q22，包含212個(gè)氨基酸，分子量23 kD，是一種雙特異性磷酸酶蛋白，屬于CDC14s家族，可對(duì)磷酸化絲氨酸/蘇氨酸發(fā)揮去磷酸化作用[4-5]。

然而，隨著對(duì)CDKN3的深入研究發(fā)現(xiàn)，CDKN3在不同腫瘤類型中發(fā)揮不同的功能。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、慢性粒細(xì)胞性白血病及神經(jīng)母細(xì)胞瘤中可抑制細(xì)胞增殖[6-9]，作為抑癌基因發(fā)揮功能，但在肝癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、腎癌、前列腺癌及乳腺癌中則呈高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖進(jìn)而發(fā)揮促癌作用，并且在肺癌、宮頸癌、甲狀腺癌及腎癌中CDKN3高表達(dá)提示預(yù)后不良[8，10-18]。在腫瘤診斷方面，CDKN3高表達(dá)識(shí)別宮頸癌組織的敏感性達(dá)93%，特異性達(dá)96%，并可以識(shí)別宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變[19]，由此推測(cè)其在早癌及癌前疾病診斷方面亦有重要價(jià)值。此外，CDKN3還與腫瘤耐藥性相關(guān)[20]。因此，CDKN3在腫瘤診治及預(yù)后判斷中均有重要作用，但目前對(duì)于CDKN3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同作用的機(jī)制尚不確定。

2 CDKN3在腫瘤中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

2.1 CDKN3在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用

CDK2在調(diào)控G1/S期中發(fā)揮重要作用，CDK2 Thr160磷酸化可促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期[21]，促進(jìn)細(xì)胞增殖。CDKN3可將CDK2活化必需的Thr160去磷酸化[3]，抑制其對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Retinoblastoma，Rb)的磷酸化作用，未磷酸化的Rb蛋白可以與轉(zhuǎn)錄因子E2F1結(jié)合，抑制G1/S期轉(zhuǎn)化，從而抑制細(xì)胞增殖。Chen等[8]在白血病K562細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)CDKN3后，磷酸化CDK2表達(dá)下調(diào)，抑制細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化，敲低CDKN3表達(dá)后獲得相反結(jié)果，同時(shí)CDKN3過(guò)表達(dá)可抑制正常骨髓細(xì)胞向白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)化，證實(shí)CDKN3通過(guò)去磷酸化CDK2抑制G1/S期轉(zhuǎn)化進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用。CDKN3不僅參與調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)化，Nalepa等[22]研究結(jié)果表明CDKN3在細(xì)胞分裂期也有一定調(diào)控作用，該研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)HeLa細(xì)胞進(jìn)入分裂期時(shí)，內(nèi)源性CDKN3的分布由分裂間期的細(xì)胞核轉(zhuǎn)為中心體，在分裂后期通過(guò)對(duì)CDK1 Thr161去磷酸化作用，維持中心體正常數(shù)目，調(diào)控細(xì)胞周期，當(dāng)敲低CDKN3表達(dá)后，出現(xiàn)中心體數(shù)量異常的同時(shí)，細(xì)胞周期進(jìn)程也會(huì)加快。此外，也有研究表明CDKN3在分裂期可與磷酸化的Mps1結(jié)合，誘導(dǎo)其降解，以維持Mps1在中心體的正常水平，避免因中心體過(guò)度復(fù)制引起細(xì)胞異常分裂[23]。因此，CDKN3通過(guò)調(diào)控G1/S期和細(xì)胞分裂后期中心體數(shù)量，維持細(xì)胞正常分裂，發(fā)揮抑癌作用。

CDKN3作為促癌基因?qū)?xì)胞周期的調(diào)控作用通過(guò)促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)，但在不同腫瘤細(xì)胞中相關(guān)的作用蛋白不盡相同。在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中，敲低CDKN3導(dǎo)致G1/S期停滯與CDKN1和PCNA的表達(dá)水平下調(diào)相關(guān)[24]，在胃癌SGC-7901細(xì)胞中則與CDK2、CDC25A、CCNB1和CCNB表達(dá)下調(diào)相關(guān)[14]，在前列腺癌及卵巢癌細(xì)胞中均與PCNA和CDK2表達(dá)下調(diào)相關(guān)[12，18]。此外，CDKN3亦可與MDM2-p53形成復(fù)合物，通過(guò)抑制p21表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程[25]。就目前研究結(jié)果而言，PCNA和CDK2在多種腫瘤中的表達(dá)水平均受CDKN3影響，是否提示這兩種蛋白是CDKN3促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的核心蛋白以及可能的作用通路仍需更深入的研究。

2.2 CDKN3突變體

2000年，Yeh等[26]首次在進(jìn)展期肝癌活檢組織、手術(shù)切除早期肝癌/癌旁組織、肝炎組織中發(fā)現(xiàn)CDKN3突變體。該研究發(fā)現(xiàn)在12例肝炎組織中均為野生型CDKN3，13例早期肝癌組織中6例出現(xiàn)突變體，除1例外均與野生型CDKN3共存，而在14例進(jìn)展期肝癌組織中8例出現(xiàn)突變體，僅2例與野生型共存，表明在肝癌進(jìn)展過(guò)程中，野生型CDKN3表達(dá)逐漸減少，進(jìn)一步對(duì)突變體研究發(fā)現(xiàn)，僅T4-2和T7兩種突變體可與CDK2結(jié)合，但無(wú)去磷酸化作用，因此可競(jìng)爭(zhēng)性抑制野生型CDKN3的抑癌功能，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。2003年，該團(tuán)隊(duì)又從肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2中檢測(cè)到K2-K6五種CDKN3剪接異構(gòu)體，通過(guò)酵母雙雜交體系發(fā)現(xiàn)CDKN3與CDK2相互作用的位點(diǎn)在氨基端1-34氨基酸區(qū)域，擁有該結(jié)構(gòu)域的剪接異構(gòu)體可干擾野生型CDKN3與CDK2的相互作用[27]。為明確CDKN3突變體在其他腫瘤中的表達(dá)情況，Yu等[6]在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)2種剪接異構(gòu)體(外顯子2和3異常剪接)，均不能翻譯全長(zhǎng)的CDKN3，導(dǎo)致CDKN3 mRNA水平升高，但野生型CDKN3蛋白水平降低。因此，在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，由于CDKN3突變體出現(xiàn)，一方面可降低野生型CDKN3蛋白表達(dá)水平，另一方面可與CDK2結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性抑制野生型CDKN3的抑癌功能，這解釋了在某些腫瘤中雖然CDKN3高表達(dá)，但仍是一種抑癌基因。

然而，Pita等[17]的研究結(jié)果表明，CDKN3在正常甲狀腺組織中均為野生型，在低/未分化甲狀腺癌中存在以外顯子2缺失為主的異常剪接體，但仍以野生型CDKN3為主，且與正常甲狀腺組織相比，腫瘤組織中野生型及總CDKN3(野生型+異常剪接體)mRNA水平均顯著升高，提示CDKN3突變體在甲狀腺癌中并不影響野生型CDKN3的表達(dá)。此外，在宮頸癌中的研究也獲得相似結(jié)果[13]，該研究在45例宮頸癌組織、22例正常組織及CaSki，HeLa和SiHa三種宮頸癌細(xì)胞系中檢測(cè)到多種CDKN3轉(zhuǎn)錄突變體，但均以野生型為主，且每種突變體的mRNA水平在腫瘤與正常組織中無(wú)顯著差異，而Western blot僅能檢測(cè)到野生型CDKN3，同時(shí)在3系宮頸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染僅對(duì)野生型CDKN3具有敲低作用的siRNA后，細(xì)胞增殖能力降低。由此，CDKN3在甲狀腺癌及宮頸癌中呈高表達(dá)發(fā)揮促癌作用，并非因突變體的存在降低野生型CDKN3蛋白表達(dá)或抑制野生型CDKN3功能所致。

2.3 CDKN3在細(xì)胞凋亡及侵襲遷移中的作用

盡管CDKN3是一種周期相關(guān)蛋白，但Yu等[6]在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤研究中發(fā)現(xiàn)，CDKN3亦可通過(guò)間接作用于CDK1，抑制細(xì)胞遷移能力。進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，CDKN3一方面可通過(guò)直接結(jié)合并活化ROCK2，抑制RAC1、PAK1，進(jìn)而抑制細(xì)胞侵襲遷移能力，另一方面CDKN3可去磷酸化CDK2，進(jìn)而降低磷酸化Rb，增加未磷酸化Rb與E2F結(jié)合，間接抑制CDK1作用，抑制侵襲遷移[7]。目前，對(duì)CDKN3促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，其可通過(guò)降低磷酸化CDK2蛋白水平，抑制下游抗凋亡蛋白XIAP的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]，發(fā)揮抑癌作用。

CDKN3抑制細(xì)胞凋亡機(jī)制因腫瘤類型不同而不同。在乳腺癌細(xì)胞系中，通過(guò)影響B(tài)cl-2與Bax表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡[16]，在肝癌Huh-7細(xì)胞中，則通過(guò)影響凋亡相關(guān)活性蛋白PTEN、GSK、p44/42和AKT表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[28]。此外，CDKN3促進(jìn)腫瘤侵襲遷移的作用與侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)水平相關(guān)[18]。

2.4 CDKN3亞細(xì)胞定位

Lai等[15]在58例腎癌組織中通過(guò)免疫組化檢測(cè)CDKN3表達(dá)及分布情況，結(jié)果表明CDKN3主要位于腎癌細(xì)胞的細(xì)胞核，胞漿分布多出現(xiàn)在低分化癌細(xì)胞中。而Barron等[13]研究結(jié)果表明，在宮頸癌組織中，CDKN3在細(xì)胞漿和細(xì)胞核均有表達(dá)且要強(qiáng)于正常宮頸組織，在HPV16陽(yáng)性癌組織中，以胞漿分布為主，在其他HPV陽(yáng)性組織中則無(wú)此現(xiàn)象。目前關(guān)于CDKN3亞定位相關(guān)研究較少，因此，CDKN3在不同腫瘤組織中發(fā)揮不同作用是否因亞細(xì)胞定位不同所致，是CDKN3亞細(xì)胞定位改變引起腫瘤發(fā)生發(fā)展還是其他因素，如細(xì)胞分化程度、HPV感染等引起其亞細(xì)胞定位發(fā)生改變等問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究。

3 小結(jié)與展望

由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制不明確，導(dǎo)致腫瘤的早期治療及預(yù)后差強(qiáng)人意。CDKN3在腫瘤診斷、治療耐藥及預(yù)后判斷方面均發(fā)揮作用，臨床應(yīng)用前景廣闊。目前相關(guān)研究結(jié)果表明CDKN3作用機(jī)制涉及到細(xì)胞周期、凋亡、侵襲遷移及突變體等多個(gè)方面，但仍不能解釋為何其在不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。因此，下一步基礎(chǔ)研究應(yīng)明確在細(xì)胞癌變過(guò)程中與CKDN3相互作用的關(guān)鍵底物及作用通路，并在臨床多組織類型、不同病理級(jí)別的樣本中評(píng)價(jià)CDKN3在腫瘤早診及治療方面的價(jià)值，以盡快實(shí)現(xiàn)CDKN3臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，提高腫瘤診治水平并改善預(yù)后。