miR21對宮頸癌Hela細(xì)胞及順鉑耐藥Hela/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響

岳曉雪+苗勁蔚+路攀

[摘要] 目的 探討miR21基因表達(dá)水平對宮頸癌Hela細(xì)胞及其順鉑耐藥Hela/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響。 方法 利用riboFECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑分別將成熟miR21 mimic、inhibitor及其陰性對照試劑NC轉(zhuǎn)染至Hela與Hela/DDP細(xì)胞，并將Hela細(xì)胞分為mimic組、陰性對照（NC）組和空白對照（Blank）組，將Hela/DDP細(xì)胞分為inhibitor組、陰性對照NC組和空白對照（Blank）組。Real-time PCR檢測各組細(xì)胞中miR21的表達(dá)水平；MTT檢測各組細(xì)胞對順鉑的半數(shù)抑制率濃度（IC50值）。 結(jié)果 ①Real-time PCR檢測miR21在Hela/DDP中高表達(dá)，是Hela的（5.452±0.074）倍（P < 0.01）；轉(zhuǎn)染mimic后，Hela中miR21表達(dá)高于明顯NC組及Blank組（P < 0.01），NC組與Blank組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；轉(zhuǎn)染inhibitor后，Hela/DDP中miR21表達(dá)明顯低于NC組及Blank組（P < 0.01），NC組與Blank組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。②MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染mimic后Hela細(xì)胞對順鉑敏感性下降，與NC組及Blank組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），NC組與Blank組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；轉(zhuǎn)染inhibitor后Hela/DDP細(xì)胞對順鉑敏感性增加，與NC組及Blank組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），NC組與Blank組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 ①miR21在Hela/DDP中高表達(dá)，在Hela中低表達(dá)。②上調(diào)miR21在Hela中的表達(dá)能明顯降低其對順鉑的敏感性，下調(diào)miR21在Hela/DDP中的表達(dá)能明顯增加其對順鉑的敏感性。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌細(xì)胞；順鉑耐藥細(xì)胞；miR21；順鉑；化療敏感性

[中圖分類號] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（c）-0025-04

[Abstract] Objective To detect the influence of miR21 gene expression on the sensitivity of cervical cancer Hela cells and cisplatin-resistant Hela/DDP cells to cisplatin. Methods Mature miR21 mimic， inhibitor and negative control （NC） miRNA were transfected into Hela and Hela/DDP cells by riboFECTTM CP. Hela cells were divided into mimic group， NC group and Blank group and Hela/DDP were divided into inhibitor group， NC group and Blank group. Real-time PCR was used to measure the expression of miR21 in each group. MTT was used to detect the half inhibitory concentration （IC50） of cisplatin. Results ①Real-time PCR results showed that the expression of miR21 was an average of （5.452±0.074） fold higher in Hela/DDP than in Hela （P < 0.01）. The expression of miR21 in mimic group was obviously higher than those in NC and Blank groups （P < 0.01）. The expression of miR21 in inhibitor group was significantly lower than those in NC and Blank groups （P < 0.01）. There was no statistical difference between NC group and Blank group in Hela and Hela/DDP cells （P > 0.05）. ②MTT results showed that the sensitivity of Hela to cisplat in decreased after mimic transfection while the Hela/DDP increased after transfected with inhibitor （P < 0.05）. There was no significant difference between NC group and Blank group （P > 0.05）. Conclusion ①The expression of miR21 is upregulated in Hela/DDP cells， while it wis down regulated in Hela cells. ②Over expression of miR21 in Hela can reduce its sensitivity to cisplatin obviously. Inhibition of miR21 in Hela/DDP can significantly increase its sensitivity tocisplatin.endprint

[Key words] Hela； Hela/DDP； miR21； Cisplatin； Cheo？鄄sensitivity

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。目前治療方案主要為手術(shù)輔助鉑類藥物化療及同步放化療。同步放化療相比單純放療可明顯提高中晚期宮頸癌患者的生存率，延長生存時間[2]。鉑類抗癌藥物作為術(shù)前或術(shù)后的輔助治療，在一定程度上改善了患者預(yù)后，在宮頸癌的治療中占有重要位置。有研究結(jié)果提示，某些基因的表達(dá)水平可能與腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性相關(guān)[3-4]。microRNAs是一類單鏈非編碼小RNA，可通過調(diào)控不同靶點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性方面發(fā)揮重要作用[5-6]。研究表明miR21與多種腫瘤耐藥相關(guān)[7-10]，但其表達(dá)水平與宮頸癌化療耐藥的關(guān)系仍不清楚。因此，本研究對細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染外源性改變miR21的表達(dá)水平，進(jìn)而探索其對Hela及Hela/DDP順鉑敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞株Hela/DDP購自北那生物BNCC細(xì)胞庫，人宮頸癌親本細(xì)胞株Hela由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所惠贈，順鉑（10 mg/支）購自山東齊魯制藥有限公司（批號：H37 021358）。DMEM、胎牛血清FBS購自Gibco公司，胰蛋白酶購自南京凱基生物科技有限公司，MTT、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，miRNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒購自天根生化科技有限公司；miR21 mimic、inhibitor、negative control及riboFECTTM CP購自銳博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela、Hela/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中（5%CO2、37℃），胰酶常規(guī)消化、傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用riboFECTTM CP分別轉(zhuǎn)染mimic、inhibitor和NC。mimic組轉(zhuǎn)染50 nmol mimic，inhibitor組轉(zhuǎn)染100 nmol inhibitor，陰性對照（NC）組分別轉(zhuǎn)染mimic NC、inhibitor NC，空白對照（Blank）組不做轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 Real-time PCR檢測miR21表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，采用miRNA提取試劑盒提取總miRNA，加尾反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20 μL）：（2X）miRcute Plus miRNA Premix 10 μL，上下游引物各0.4 μL（下游引物為試劑盒配備），（50X）ROX Reference Dye 2 μL；cDNA模板各2 μL，ddH2O 5.2 μL。U6為內(nèi)參。miR21上游引物序列為5′-CCCTCACAGACTGATGTTGAAA-3′。U6基因上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 min變性；94℃20 s，64℃ 30 s，72℃，34 s（5個循環(huán)）富集目標(biāo)miRNA；94℃，20 s，60℃，34 s（45個循環(huán)）退火延伸。反應(yīng)均設(shè)三個復(fù)孔。Ct值（2-ΔΔCt）公式對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。ΔΔCt=（CtmiR21-CtU6）轉(zhuǎn)染組-（CtmiR21-CtU6）對照組。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，制備成單細(xì)胞懸液，5×103個/孔接種于96孔板中，100 μL/孔，設(shè)加藥組、調(diào)零組和空白對照組，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。貼壁后棄上清，分別在Hela和Hela/DDP細(xì)胞中加入180 μL培養(yǎng)基，20 μL終濃度為（0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160）μg/mL的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），37℃避光孵育4 h，棄上清，加DMSO 150 μL/孔，充分振蕩使結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的吸光度值，3個復(fù)孔取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件繪制細(xì)胞存活率曲線并求出IC50值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hela/DDP與Hela對順鉑的敏感性

不同濃度順鉑作用48 h后，Hela/DDP及Hela對順鉑的IC50分別為（35.480±0.155）μg/mL、（5.260±0.206）μg/mL，前者是后者的（6.754±0.235）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 Hela與Hela/DDP細(xì)胞miR21的表達(dá)

Real-time PCR法檢測Hela/DDP與Hela細(xì)胞中miR21的表達(dá)，結(jié)果顯示miR21在Hela/DDP與Hela中表達(dá)量分別為（5.450±0.081）、（1.000±0.002），前者是后者的（5.452±0.074）倍，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染mimic或inhibitor后miR21表達(dá)變化

2.3.1 Hela細(xì)胞miR21表達(dá)變化 轉(zhuǎn)染50 nm mimic后，結(jié)果顯示mimic組高表達(dá)，表達(dá)量為（7.611±0.025），與NC組（1.089±0.021）及Blank組（1.000±0.002）相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；NC組與Blank組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3A。endprint

2.3.2 Hela/DDP細(xì)胞miR21表達(dá)變化 轉(zhuǎn)染100 nm inhibitor后miR21的表達(dá)，結(jié)果顯示inhibitor組低表達(dá)，表達(dá)量為（1.181±0.030），與NC組（4.943±0.057）及Blank組（5.450±0.081）相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；NC組與Blank組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3B。

2.4 轉(zhuǎn)染mimic或inhibitor后細(xì)胞增殖的變化

2.4.1 Hela轉(zhuǎn)染mimic后細(xì)胞增殖的變化 給予不同濃度的順鉑，MTT檢測結(jié)果顯示mimic組IC50為（9.027±0.065）μg/mL，與NC組[（5.176±0.044）μg/mL]及Blank組[（5.083±0.030）μg/mL]相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；NC組與Blank組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4A。

2.4.2 Hela/DDP轉(zhuǎn)染inhibitor后細(xì)胞增殖的變化 給予不同濃度的順鉑，MTT檢測結(jié)果顯示，inhibitor組IC50為[（2.517±0.080）μg/mL]，與NC組[（31.205±0.192）μg/mL]及Blank組[（31.255±0.140）μg/mL]相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；NC組與Blank組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4B。

3 討論

miR21在實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)[11-15]，如肺癌、胰腺癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤等，也是腫瘤患者血清中第一個被檢測到的微小RNA[16]，在人類miRNA功能學(xué)研究中占有重要地位。Wang等[17]研究結(jié)果提示，miR21基因表達(dá)量在乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞中較高，干擾miR21在親本細(xì)胞中的表達(dá)可改變其對阿霉素的耐藥性。在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，下調(diào)miR21的表達(dá)可增加惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替尼泊苷敏感性[18]。改變卵巢癌及肺癌中miR21的表達(dá)也會產(chǎn)生類似的效果[19-20]。這些研究提示腫瘤細(xì)胞化療耐藥與miR21表達(dá)水平有關(guān)，然而關(guān)于miR21具體在宮頸癌化療耐藥方面的報道目前較少。

本實(shí)驗(yàn)通過Real-time PCR法研究miR21表達(dá)水平在Hela及Hela/DDP細(xì)胞中對順鉑敏感性的影響。結(jié)果提示，miR21在Hela/DDP中的表達(dá)水平高于Hela（P < 0.05）。將mimic、inhibitor及其陰性對照轉(zhuǎn)入Hela與Hela/DDP細(xì)胞，結(jié)果提示，上調(diào)miR21在Hela細(xì)胞中的表達(dá)能明顯降低其對順鉑的敏感性，下調(diào)miR21在Hela/DDP細(xì)胞中的表達(dá)能明顯增加其對順鉑的敏感性。但是miR21是通過何種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞化療敏感性仍不清楚。

miRNA裂解靶基因或抑制翻譯是通過與靶基因結(jié)合，因此推測miRNA功能的一個最直接手段是尋找下游靶基因。熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)miR21可與PTEN基因的3′UTR結(jié)合，進(jìn)而抑制靶基因表達(dá)即PTEN mRNA是miR21的一個直接作用靶點(diǎn)[17]，這為進(jìn)一步研究miR21在宮頸癌耐藥中的分子機(jī)制提供依據(jù)。

此外，本研究結(jié)果提示，miR21在Hela/DDP中表達(dá)量明顯高于Hela，且上調(diào)miR21的表達(dá)會降低Hela對順鉑的敏感性，下調(diào)miR21的表達(dá)會增加Hela/DDP對順鉑的敏感性。這為提高宮頸癌化療敏感性提供了新的靶點(diǎn)，為臨床上攻克宮頸癌化療不敏感難題提供了新思路。PTEN為miR21的直接靶點(diǎn)，故推測miR21可能通過調(diào)節(jié)PTEN影響宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥性，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（收稿日期：2017-09-21 本文編輯：李岳澤）endprint