大鼠壓瘡局部不同溫度治療對PI3K/Akt/GSK3β信號通路的影響*

王晴，白燕平，邢鳳梅，汪鳳蘭，張小麗

（華北理工大學(xué) 護理與康復(fù)學(xué)院，河北 唐山 063000）

壓瘡又稱壓力性潰瘍，常見于老年患者及長期臥床患者，是臨床上困擾醫(yī)護人員的難題之一。壓瘡的發(fā)生會增加患者痛苦，拖延治療進程，甚至?xí)^發(fā)感染致全身衰竭而危及患者的生命[1]。因此，探索壓瘡防治的有效方法是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點。目前，關(guān)于臨床壓瘡防治中局部溫度如何干預(yù)，日益引起人們的重視。對壓瘡防治的傳統(tǒng)做法，多采用局部熱療，但近年有研究顯示[2]，局部溫度升高可能會加重壓瘡損傷，而降低局部溫度對壓瘡的治療具有良好效果。在壓瘡的防治過程中，究竟采用哪種溫度更有效，尚未形成定論。當(dāng)前，缺血/再灌注損傷已成為壓瘡形成的最重要機制[3]。有研究表明[4]，肌肉組織細(xì)胞凋亡是壓瘡的發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素，而磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-OH kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）/糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡的重要途徑，在壓瘡缺血再灌注損傷中起保護作用。本實驗通過在大鼠壓瘡局部分別實施高溫、低溫干預(yù)，觀察PI3K/Akt/GSK3β信號通路的表達(dá)情況，探討不同局部溫度對壓瘡的治療效果，為壓瘡的臨床防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物體重250～300 g的SPF級雄性健康成年SD大鼠40只，由華北理工大學(xué)實驗動物中心提供。在恒溫（18～24℃）、恒濕（45%～50%）、明暗交替各12 h的條件下飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器兔源Akt、p-Akt單克隆抗體，兔源GSK3β、p-GSK3β單克隆抗體及兔源β-actin單克隆抗體（購自美國Cell Signaling Technology）；FITC熒光素標(biāo)記羊抗兔IgG（H+L）（美國KPL公司）。TUNEL試劑盒（美國Chemicon公司），電泳儀及電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠），酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司），壓瘡裝置（唐山鼓風(fēng)機器械制造廠），自制恒溫箱。

1.2 方法

1.2.1 動物造模裝置①大鼠壓瘡裝置。根據(jù)姜麗萍、蔡福滿等[5]的方法設(shè)計壓瘡裝置。該裝置主要結(jié)構(gòu)為固定支架、施壓柱（其頭端為圓形底面，半徑為0.5 cm）和泡沫板。在造模過程中大鼠受壓的部位和壓強需保持不變，已知施壓柱頭端底面面積一定，通過在上端增減砝碼便能達(dá)到受壓部位所需壓強；②恒溫箱。該裝置主要由泡沫箱、溫度計構(gòu)成，泡沫箱頂端設(shè)置通風(fēng)孔，可使箱內(nèi)空氣和外界空氣相通（見圖1）。通過預(yù)先在泡沫箱內(nèi)放入冰袋或熱水袋來調(diào)節(jié)箱內(nèi)溫度，使其達(dá)到預(yù)期溫度Δt。對大鼠進行溫度干預(yù)時，將其受壓部位放入箱內(nèi)，可根據(jù)溫度計的變化隨時打開通風(fēng)孔對箱內(nèi)溫度進行微調(diào)，將箱內(nèi)溫度保持在Δt±1℃。

圖1 造模示意圖

1.2.2 大鼠壓瘡模型的復(fù)制按照蔡福滿等[5]的方法復(fù)制大鼠壓瘡缺血再灌注損傷模型。用腹腔注射10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉大鼠，側(cè)臥位固定，將兩側(cè)大腿股薄肌處的毛剪去，暴露皮膚，在該部位施加170 mmHg（22.47 kPa）的壓力。造模需要進行5個循環(huán)，每個循環(huán)包括施壓2 h，放松0.5 h。造模過程中，將試驗環(huán)境溫度保持在22℃，期間要保證大鼠的麻醉狀態(tài)，按需補充麻藥。

1.2.3 實驗分組及處理方法將40只SPF級成年雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、常溫IRI組（NTI）、低溫IRI組（LTI）和高溫IRI組（HTI）4組，每組各10只，處理方法如下：①Sham組（10只）：只麻醉，不處理；②NTI組（10只）：麻醉后，在常溫（22℃）下施加5個缺血再灌注循環(huán)；③LTI組（10例）：將常溫22℃設(shè)為Δt，干預(yù)溫度=Δt-10℃=12℃。大鼠麻醉后施加5個缺血再灌注循環(huán)，每個循環(huán)的缺血階段（1 h）在22℃下實施，再灌注階段（0.5 h）需將其受壓部位放入溫度設(shè)為12℃的恒溫箱中；④HTI組（10只）：將常溫設(shè)為Δt，干預(yù)溫度=Δt+10℃=32℃。大鼠麻醉后施加5個缺血再灌注循環(huán)，每個循環(huán)的缺血階段（1 h）在22℃下實施，再灌注階段（0.5 h）需將其受壓部位放入溫度設(shè)為32℃的恒溫箱中；本實驗中的溫度設(shè)置參考BERNARD等[6]的實驗方法，但在其基礎(chǔ)上做了些許變動。

1.2.4 檢測方法在實驗終點于冰上切取各組大鼠受壓中心部位肌肉組織，用4℃生理鹽水洗去血液，用濾紙吸干水分，切取大小為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的組織放在4%多聚甲醛中固定，用于制備常規(guī)石蠟切片，進行組織形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞凋亡的檢測以及免疫熒光檢測；另取500 mg組織放在-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?，用于Western blot檢測。①HE染色檢測大鼠骨骼肌的病理變化。取適量肌肉組織，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片?？酒撓?，蘇木素、伊紅染色，中性樹膠封片。鏡下觀察并采集圖像；②Western blot檢測大鼠骨骼肌Akt、p-Akt和GSK3β、p-GSK3β蛋白的表達(dá)水平。取適量肌肉組織提蛋白，分裝、加熱變性。制備SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉。加一抗，4 ℃過夜。次日用TBST洗膜后加入二抗，37℃孵育1～2 h。用TBST再次洗膜，顯色，用Image J軟件分析各組蛋白條帶灰度值；③TUNEL檢測大鼠骨骼肌細(xì)胞的凋亡情況。取適量肌肉組織，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片?？酒撓灪?，按照試劑盒說明書進行操作，中性樹膠封片。光鏡下觀察染色結(jié)果并拍照計數(shù)，其陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮成棕褐色；④免疫熒光檢測大鼠骨骼肌的p-Akt與p-GSK3β表達(dá)水平。取適量肌肉組織，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片?？酒?，脫蠟，檸檬酸鈉熱修復(fù)，加3% H2O2滅活內(nèi)源性酶，血清封閉，加一抗，4℃濕盒過夜。次日加熒光素標(biāo)記二抗，37℃暗濕盒0.5 h，DAPI染核，甘油磷酸緩沖液封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，用LSD-t法進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，Sham組肌纖維排列緊密，間隙較小，骨骼肌橫紋清晰，無炎癥細(xì)胞浸潤；NTI組肌纖維排列紊亂，間質(zhì)增寬，出現(xiàn)斷裂、溶解，亦有炎癥細(xì)胞浸潤；HTI組較NTI組損傷嚴(yán)重，大量肌纖維溶解、斷裂，空泡變性，炎癥細(xì)胞浸潤增多；LTI組較NTI組損傷減輕，肌纖維排列較整齊，發(fā)生的斷裂、溶解較少，炎癥細(xì)胞浸潤亦較少（見圖2）。

圖2 各組骨骼肌病理變化 （HE×200）

2.2 各組肌肉組織Akt、Gsk3β的磷酸化水平

與Sham組比較，NTI組Akt、GSK3β的磷酸化水平下降（P＜0.05）；與NTI組比較，HTI組的磷酸化水平進一步降低（P＜0.05），而LTI組有所上升（P＜0.05）。見表 1 和圖 3。

2.3 免疫熒光結(jié)果

免疫熒光結(jié)果顯示，Sham組可見大量p-Akt和p-GSK3β的熒光表達(dá)（主要集中在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中），NTI組這兩種因子的表達(dá)量均下降。與NTI組比較，HTI組兩者的熒光表達(dá)量進一步下降，而在LTI組表達(dá)有所增加（見圖4、5）。

表1 各組肌肉組織Akt及GSK3β磷酸化水平（n =5，±s）

表1 各組肌肉組織Akt及GSK3β磷酸化水平（n =5，±s）

注：1）與Sham組比較，P ＜0.05；2）與NTI組比較，P ＜0.05

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表2 TUNEL檢測各組肌肉組織凋亡細(xì)胞數(shù)量（n =5，±s）

表2 TUNEL檢測各組肌肉組織凋亡細(xì)胞數(shù)量（n =5，±s）

注：1）與 Sham 組比較，P ＜0.05；2）與 NTI組比較，P ＜0.05

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圖3 各組肌肉組織總的Akt、GSK3β及其磷酸化水平

圖4 各組肌肉組織p-Akt的表達(dá) （免疫熒光×200）

圖5 各組肌肉組織p-GSK3β的表達(dá) （免疫熒光×200）

2.4 TUNEL染色結(jié)果

TUNEL染色結(jié)果顯示，Sham組陽性染色細(xì)胞核僅有少數(shù)，NTI組陽性細(xì)胞核數(shù)增加。與NTI組比較，凋亡細(xì)胞數(shù)在HTI組進一步增加，而在LTI組有所減少（見表4和圖6）。

圖6 各組骨骼肌細(xì)胞凋亡情況 （TUNEL×200）

3 討論

壓瘡的形成是多種因素共同作用的結(jié)果，而缺血再灌注損傷被認(rèn)為是壓瘡形成最主要的機制[3]。研究表明，與皮膚組織比較，肌肉組織由于存在更豐富的血管對缺血再灌注損傷更為敏感，因而深部組織損傷（DTI）在壓瘡發(fā)展中起關(guān)鍵作用。因此本實驗在研究壓瘡損傷時以肌肉組織為中心。研究發(fā)現(xiàn)[4]，壓瘡的發(fā)生與肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，肌肉組織因受缺血缺氧等刺激而誘發(fā)骨骼肌細(xì)胞凋亡，是壓瘡病理發(fā)展的根源。PI3K/Akt/GSK3β通路是介導(dǎo)凋亡發(fā)生的重要途徑，在壓瘡形成進展中起保護作用。

過去在臨床防治壓瘡中多應(yīng)用熱療，認(rèn)為受壓部位溫度升高可促進局部血液循環(huán)，提高細(xì)胞功能從而減少組織損傷[7]。護理教材中也曾寫到[8]：Ⅱ期壓瘡應(yīng)以紅外線照射瘡面，Ⅲ期壓瘡用鵝頸燈照射。但近年有研究報導(dǎo)[2]：受壓區(qū)域溫度升高會增加局部組織的代謝需氧量，進而增加壓瘡的發(fā)生率。相反，降低溫度可通過減少局部組織代謝需氧量，抑制損傷后炎癥因子擴散和中性粒細(xì)胞浸潤等來減輕缺血再灌注損傷[6]。近年來，臨床上陸續(xù)有研究顯示[9-11]，在防治壓瘡時設(shè)法降低局部溫度具有良好效果。目前相關(guān)壓瘡溫度干預(yù)的研究大多是臨床方面的研究，鮮有通過基礎(chǔ)實驗獲得的理論支持。

本實驗HE和TUNEL結(jié)果顯示，NTI組骨骼肌嚴(yán)重?fù)p傷，出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，說明造模成功。而LTI組與NTI組相比骨骼肌損傷有所減輕，凋亡細(xì)胞減少，說明局部溫度降低可減輕壓瘡缺血再灌注損傷，這與BERNARD等[6]的研究結(jié)果一致。HTI組與NTI組相比損傷加重，凋亡細(xì)胞增多，說明升高局部溫度會加重壓瘡組織的損傷。

PI3K/Akt/GSK3β信號通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的生命傳導(dǎo)通路，參與多項細(xì)胞生理活動，并介導(dǎo)多種外界刺激信號誘導(dǎo)細(xì)胞存活、生長、分化及凋亡等過程，它的激活表現(xiàn)為相關(guān)靶點的磷酸化，磷酸化水平越高，發(fā)揮的抗細(xì)胞凋亡作用越強，對缺血灌注損傷的保護作用就越強[12]。PI3K由磷脂酰肌醇的肌醇環(huán)上的碳原子磷酸化形成，是細(xì)胞內(nèi)重要轉(zhuǎn)導(dǎo)信號分子之一。PI3K激活后與下游的直接靶點Akt發(fā)生相互作用，使其被激活并產(chǎn)生磷酸化，而磷酸化Akt具有促細(xì)胞生存、抗細(xì)胞調(diào)亡的作用[13]。GSK3β是Akt下游的一種活性激酶，可引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，使線粒體出現(xiàn)功能障礙加劇細(xì)胞損傷；促進Caspase-3激活以及細(xì)胞色素C釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。磷酸化Akt可促進GSK3β產(chǎn)生磷酸化，使其生物活性顯著降低，即磷酸化GSK3β的是非活性狀態(tài)，可減少線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，抑制Caspase-3激活以及細(xì)胞色素C釋放，從而抑制凋亡，減輕細(xì)胞損傷[14]。

Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示，和Sham組比較，NTI組Akt和GSK3β的磷酸化水平降低，說明壓瘡損傷可通過抑制PI3K/Akt/GSK3β通路中Akt和GSK3β的磷酸化水平而引起骨骼肌細(xì)胞損傷和凋亡；局部經(jīng)高溫干預(yù)后，壓瘡組織中這兩種因子的磷酸化水平在NTI組的基礎(chǔ)上進一步下降，組織損傷程度加重；經(jīng)低溫干預(yù)后，局部組織中Akt和GSK3β的磷酸化水平較NTI組有所上升，細(xì)胞損傷和凋亡和凋亡也有所減輕。

綜上所述，局部高溫可能通過抑制PI3K/Akt/GSK3β通路中Akt和GSK3β的磷酸化水平而促進細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進而加重大鼠壓瘡損傷；與之相反，局部低溫可能通過提高Akt和GSK3β的磷酸化水平而減輕大鼠壓瘡損傷。因此，在對壓瘡的臨床防治過程中，可能不宜使用熱干預(yù)方法，使用冷干預(yù)可能會有良好效果。

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